Държавен вестник, бр. 68, 2014 г., стр. 94

СТР.  94	
Д Ъ Р Ж А В Е Н  В Е С Т Н И К 	
БРОЙ  68
4.12. Метанол
4.13. Ацетонитрил
4.14. Сярна киселина (Н2SO4) разтвор 2 mol/
dm3 (mol/l)
4.15. Смес етанол/вода. Смесват се 9 обема 
етанол (т. 4.2) и 1 обем вода.
4.16. Разтвор на вътрешен стандарт. Претеглят 
се около 0,25 g с точност 0,001 g изопропилпа­
рабен (т. 4.8), прехвърлят се в мерителна колба 
от 500 cm3 (ml) и след разтваряне се долива до 
марката със смес етанол/вода (т. 4.15)
4.17. Подвижна фаза: тетрахидрофуран/вода/
метанол/ацетонитрил.
Смесват се 5 обема тетрахидрофуран, 60 
обема вода, 10 обема метанол и 25 обема аце­
тонитрил. 	
4.18. Изходни стандартни разтвори на кон­
сервантите. Претеглят с точност 0,001 g 0,2 g 
2-феноксиетанол, 0,2 g 1-феноксипропан-2-
ол, 0,05 g метилпарабен, 0,05 g етилпарабен, 
0,05 g бутилпарабен и 0,025 g бензилпарабен 
в мерителни колби от 100 cm3 (ml) и разтво­
рите се доливат до марката със смес етанол/
вода (т. 4.15).
Разтворите са стабилни до една седмица при 
съхраняване в хладилник.
4.19. Стандартни разтвори на консервантите. 
От изходните стандартни разтвори (т. 4.18) се 
прехвърлят съответно 20,00 cm3 (ml), 10 cm3 
(ml) 5,00 cm3 (ml), 2,00 cm3 (ml) и 1,00 cm3 (ml) 
в мерителни колби от 50 cm3 (ml). Във всяка 
колба се прибавят по 10 cm3 (ml) разтвор на 
вътрешния стандарт (т. 4.16) и 1,0 cm 3 (ml) 
разтвор на сярна киселина (т. 4.14) и се доли­
ва до марката със смес етанол/вода (т. 4.15). 
Разтворите трябва да са приготвени непосред­
ствено преди употреба.
5. Апаратура
Стандартно лабораторно оборудване и:
5.1. Водна баня с възможност за поддържане 
на температура 60 °С ± 1 °С.
5.2. Хроматограф за високоефективна течна 
хроматография с УВ детектор, дължина на 
вълната 280 nm.
5.3. Аналитична колона от неръждаема сто­
мана 25 cm х 4,6 mm (или 12,5 cm х 4,6 mm), 
съдържаща Nucleosil 5С18 или еквивалент (виж 
т. 10.1).
5.4. Стъклени колби от 100 cm3(ml) със за­
пушалки.
5.5. Пемза с размери на зърната от 2 mm 
до 4 mm.
6. Процедура
6.1. Подготовка на пробата
6.1.1. Подготовка на пробата без добавяне 
на вътрешен стандарт.
Претегля се около 1,0 g от пробата с точ­
ност 0,001 g в стъклена колба от 100 cm 3 (ml) 
със запушалка (т. 5.4). Добавят се 1,0 cm 3 (ml) 
разтвор на сярна киселина (т. 4.14), 50,0 cm 3 
(ml) етанол/водна смес (т. 4.15) и около 1,0 g 
пемза (т. 5.5). Колбата се запушва и се раз­
клаща силно, докато се получи хомогенна 
суспензия. За улесняване екстракцията на 
консервантите в етаноловата фаза колба­
та се нагрява 5 min на водна баня (т. 5.1) 
при температура 60 °С ± 1 °С. След това 
се охлажда бързо на течаща студена вода 
и престоява в хладилник 1 h. Филтрува се 
през книжен филтър и около 2 cm 3 (ml) от 
филтрата се прехвърлят в епруветка от 5 сm 3 
(ml) със запушалка. Екстрактът се съхранява 
в хладилник. ВЕТХ определянето трябва да 
се извърши до 24 h.
6.1.2. Подготовка на пробата с добавяне на 
вътрешен стандарт
Претегля се около 1,0 g ± 0,1 от пробата 
с точност 0,001 g и се прехвърля в колба от 
100 cm3 (ml). Добавят се 1,0 cm3 (ml) разтвор 
на сярна киселина (т. 4.14) и 40 cm3 (ml) смес 
етанол/вода (т. 4.15), около 1,0 g пемза (т. 5.5) 
и точно 10,0 cm3 (ml) разтвор на вътрешен 
стандарт (т. 4.16). Колбата се запушва и се 
разклаща силно най-малко 1 min, докато се 
получи хомогенна емулсия. За улесняване 
екстракцията на консервантите в етаноловата 
фаза колбата се загрява 5 min на водна баня 
при температура 60 °С ± 1 °С, след което 
се охлажда бързо на течаща студена вода и 
престоява в хладилник 1 h. Филтрува се през 
книжен филтър. Около 2 cm3 (ml) от филтрата 
се прехвърлят в епруветка от 5 cm3 (ml) със 
запушалка. Съхранява се в хладилник до про­
веждане на ВЕТХ определянето.
6.2. Високоефективна течна хроматография 
(ВЕТХ)
6.2.1. Хроматографски условия:
Подвижна фаза – тетрахидрофуран/вода/
метанол/ацетонитрил (т. 4.17)
Скорост на потока – 1,5 cm3/min (ml/min)
Дължина на вълната – 280 nm
6.2.2. Стандартна крива
Инжектират се по 10 µl от стандартните раз­
твори на консервантите (т. 4.19). От получените 
хроматограми се определят съотношенията на 
височината на пиковете на стандартните раз­
твори на консервантите към височината на пика 
на вътрешния стандарт. Построява се крива за 
всеки консервант, свързваща тези съотношения 
с концентрацията на стандартните разтвори.
6.2.3. Определяне
Инжектират се последователно по 10 µl от 
разтвора на пробата без вътрешен стандарт 
(т. 6.1.1) и на един от стандартните разтвори на 
консерванта (т. 4.19) и получените хроматограми 
се сравняват. Ако в хроматограмата на пробата 
(т. 6.1.1) не се появи пик, с приблизително същото 
време на задържане като това на изопропилпа­
рабена (препоръчан като вътрешен стандарт), се 
инжектират 10 µl разтвор на пробата с вътрешен 
стандарт (т. 6.1.2). Хроматограмата се изписва 
и се измерват височините на пиковете. Ако в 
хроматограмата на пробата се появи пречещ пик 
с приблизително същото време на задържане 
като това на изопропилпарабена, трябва да се 
избере друг вътрешен стандарт.
Когато пикът на някои от изследваните 
консерванти не присъства в хроматограмата на 
пробата, този консервант може да се използва 
като алтернативен вътрешен стандарт.