Държавен вестник, бр. 91, 2002 г., стр. 94

С Т Р .  94
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  91
рабен, 0,05 g етилпарабен, 0,05 g бутилпарабен и 0,025 g
бензилпарабен в мерителни колби от 100 cm3 (ml) и
разтворите се доливат до марката със смес етанол/
вода (4.15).
Разтворите са стабилни до една седмица при съхра-
няване в хладилник.
4.19. Стандартни разтвори на консервантите. От
изходните стандартни разтвори (4.18) се прехвърлят
съответно 20 cm3 (ml), 10 cm 3 (ml) 5,00 cm3 (ml),
2,00 cm3 (ml) и 1,00 cm3 (ml) в мерителни колби от
50 cm3 (ml). Във всяка колба се прибавят по 10 cm3 (ml)
разтвор на вътрешния стандарт (4.16) и 1,0 cm3 (ml)
разтвор на сярна киселина (4.14) и се долива до марката
със смес етанол/вода (4.15). Разтворите трябва да са
приготвени непосредствено преди употреба.
5. Апаратура
Стандартно лабораторно оборудване и:
5.1. Водна баня с възможност за поддържане на
температура 60 °С ± 1 °С
5.2. Хроматограф за високоефективна течна хрома-
тография с УВ детектор, дължина на вълната 280 nm.
5.3. Аналитична колона от неръждаема стомана
25 cm Ч 4,6 mm (или 12,5 cm Ч 4,6 mm), съдържаща
Nucleosil 5С18 или еквивалент (виж 10.1).
5.4. Стъклени колби от 100 cm3 (ml) със запушалки.
5.5. Пемза с размери на зърната от 2 mm до 4 mm.
6. Процедура
6.1. Подготовка на пробата
6.1.1. Подготовка на пробата без добавяне на вътре-
шен стандарт.
Претегля се около 1,0 g от пробата с точност
0,001 g в стъклена колба 100 cm3 (ml) със запушалка
(5.4). Добавят се 1,0 cm3 (ml) разтвор на сярна кисе-
лина (4.14), 50 cm3 (ml) етанол/водна смес (4.15) и
около 1,0 g пемза (5.5). Колбата се запушва и се раз-
клаща силно, докато се получи хомогенна суспен-
зия. За улесняване екстракцията на консервантите в
етаноловата фаза колбата се нагрява 5 min на водна
баня (5.1) при температура 60 °С ± 1 °С. След това се
охлажда бързо на течаща студена вода и престоява в
хладилник 1 h. Филтрува се през книжен филтър и
около 2 cm3 (ml) от филтрата се прехвърлят в епру-
ветка от 5 сm3 (ml) със запушалка. Екстрактът се
съхранява в хладилник. ВЕТХ определянето трябва
да се извърши до 24 h.
6.1.2. Подготовка на пробата с добавяне на вътре-
шен стандарт
Претегля се около 1,0 g ± 0,1 от пробата с точност
0,001 g и се прехвърля в колба 100 cm3 (ml). Добавят се
1,0 cm3 (ml) разтвор на сярна киселина (4.14) и
40 cm3 (ml) смес етанол/вода (4.15), около 1,0 g пемза
(5.5) и точно 10,0 cm3 (ml) разтвор на вътрешен стан-
дарт (4.16). Колбата се запушва и се разклаща силно
най-малко 1 min, докато се получи хомогенна емул-
сия. За улесняване екстракцията на консервантите в
етаноловата фаза колбата се загрява 5 min на водна
баня при температура 60 °С ± 1 °С, след което се ох-
лажда бързо на течаща студена вода и престоява в
хладилник 1 h. Филтрува се през книжен филтър. Око-
ло 2 cm3 (ml) от филтрата се прехвърлят в епруветка от
5 cm3 (ml) със запушалка. Съхранява се в хладилник до
провеждане на ВЕТХ определянето.
6.2. Високоефективна течна хроматография (ВЕТХ)
6.2.1. Хроматографски условия:
—Подвижна фаза: тетрахидрофуран/вода/метанол/
ацетонитрил (4.17)
—Скорост на потока: 1,5 cm3/min (ml/min)
—Дължина на вълната: 280 nm
6.2.2. Стандартна крива
Инжектират се по 10 µl от стандартните разтвори
на консервантите (4.19). От получените хроматограми
се определят съотношенията на височината на пикове-
те на стандартните разтвори на консервантите към ви-
сочината на пика на вътрешния стандарт. Построява се
крива за всеки консервант, свързваща тези съотноше-
ния с концентрацията на стандартните разтвори.
6.2.3. Определяне
Инжектират се последователно по 10 µl от разтвора
на пробата без вътрешен стандарт (6.1.1) и на един от
стандартните разтвори на консерванта (4.19) и получе-
ните хроматограми се сравняват. Ако в хроматограма-
та на пробата (6.1.1) не се появи пик с приблизително
същото време на задържане като това на изопропилпа-
рабена (препоръчан като вътрешен стандарт), се ин-
жектират 10 µl разтвор на пробата с вътрешен стандарт
(6.1.2). Хроматограмата се изписва и се измерват висо-
чините на пиковете. Ако в хроматограмата на пробата
се появи пречещ пик, с приблизително същото време на
задържане като това на изопропилпарабена, трябва да
се избере друг вътрешен стандарт.
Когато пикът на някои от изследваните консерван-
ти не присъства в хроматограмата на пробата, този
консервант може да се използва като алтернативен
вътрешен стандарт.
Изчисляват се съотношенията на височината на пика
на изследваните консерванти към тези на вътрешния
стандарт и се проверява дали за стандартните разтвори,
използвани в процедурата за калибриране, се получава
линейна зависимост.
Получените хроматограми на стандартния разтвор
и на разтвора на пробата трябва да отговарят на след-
ните изисквания:
—Разделянето на пиковете (р) на най-лошо разде-
лената двойка трябва да бъде не по-малко от 0,90 (за
дефиниция на пиково разделяне виж фиг. 1).
Ако не е постигнато необходимото разделяне, тряб-
ва да се използва по-ефективна колона или друга по
състав подвижна фаза.
—Коефициентът на асиметрия (As) на всички полу-
чени пикове трябва да бъде в интервала от 0,9 до 1,5 (за
дефиницията на коефициент на асиметрия виж фиг. 2).
Препоръчва се хроматограмата за определяне кое-
фициента на асиметрия да се записва при скорост най-
малко 2 cm/min.
—Базовата линия трябва да е стабилна.
7. Изчисление
Изчисляването на концентрациите на консерванти-
те в разтвора на пробата се извършва по стандартната
крива (6.2.2) и съотношенията на височините на пико-
вете на изследваните консерванти към тази на вът-
решния стандарт. Съдържанието на 2-феноксиетанол,
1-феноксипропан-2-ол, метил 4-хидроксибензоат, етил
4-хидроксибензоат, пропил 4-хидроксибензоат, бутил
4-хидроксибензоат и бензил 4-хидроксибензоат (Wi) се
изчисляват като % (М/М) по формулата:
bi
 % Wi (M/M) = –––––– ,
200 Ч M
където:
bi е концентрацията на консерванта i в разтво-
ра на пробата, отчетена по стандартната крива, в
µg/dm3 (µg/l);
М—масата на изпитваната проба в g.
8. Повторяемост (1)
Виж 10.5
Фиг. 1. Коефициент на разделяне на пиковете
(1) виж ISO 5725