Държавен вестник, бр. 98, 2002 г., стр. 13

Б Р О Й  98
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
С Т Р .  13
3. Сандвич ЕЛАЙЗА
Най-малко две ЕЛАЙЗА са разработени за до-
казване на вирусен антиген от теренни проби или
лабораторно заразени клетъчни култури. Едната
техника използва поликлонални антитела (ПКА),
а другата—моноклонални (МКА), на един и същ
основен протеин, който е общ за повечето сероти-
пове на заболяването—VP7. Двата метода могат
да се прилагат независимо един от друг, като чрез
тях бързо (от 2 до 4 часа) се поставя диагноза АЧК.
Реагентите за тези реакции се получават в случай
на нужда от Референтната лаборатория за АЧК в
Европейския съюз.
3.1. Извършване на ЕЛАЙЗА теста при изпол-
зването на моноклонално антитяло
3.1.1. Твърда фаза—плаките се натоварват със
смес от МКА 5G5 и 3D2, разтворени в PBS съот-
ветно 10 µl/ml всяко с последвала инкубация една
нощ на 4 °С.
3.1.2. След трикратно промиване на плаките с
дестилирана вода, съдържаща 0,05 % Tween 20, те
внимателно се изтръскват върху адсорбиращ ма-
териал до отстраняване на излишната течност в
ямките.
3.1.3. Накапва се по 200 µl/на ямка блокиращ
разтвор, съдържащ PBS + 1 % говежди серумен
албумин (БСА) за един час на 37 °С.
3.1.4. Изсипва се внимателно блокиращият раз-
твор и се изтръскват плаките.
3.1.5. Пробите за изследване (далачни суспен-
зии или клетъчно културална течност) се накап-
ват в неразредено състояние, последвано от две
разреждания в PBS+1 % БСА по 100 µl на ямка, с
последвала инкубация от 1 час на 37 °С. Суспензи-
ята от органи (далак, бял дроб, л. възел) се получа-
ва, като 2 см около 1 г от органа се хомогенизира
в 3 мл MEM (Minimal essential medium) среда, с
последвало центрофугиране на 600 g за 10 мин.,
като се използва супернатантът.
3.1.6. Плаките се промиват трикратно.
3.1.7. Във всяка ямка се накапва конюгат—по
100 µl биотин-макрирано 5G5 МКА, в разреждане
1:500 в PBS+1 %БСА. След инкубиране за един час
на 37 °С плаките се промиват и се накапва по 100 µl
на ямка авидин—пероксидаза в оптимално разреж-
дане в PBS+1 % БСА, с последвал престой 45 мин.
на стайна температура.
3.1.8. Плаките се промиват трикратно и в тях се
накапва по 200 µl на ямка субстратен разтвор 10 мл
80,6 mM DMAB (dimethyl aminobenzaldehyde) +
10 мл fj 1,56 mM MBTH (3-methyl-2-benzo-thiazolinone
hydrazone) + 5 µl H2O2. Цветната реакция се спира
чрез прибавяне на 50 µl разтвор на 3N H2SO4 за около
5—10 мин., преди отрицателната контрола да започ-
не да се оцветява.
3.1.9. Плаките се отчитат на ридър при 600 или
620 nm.
3.2. Интерпретиране на резултатите
3.2.1. Първо се изчислява cut-off стойността, как-
то следва—С + 0,06 (където С е стойността на отри-
цателната контрола, 0,6 е стандартното отклонение,
получено при група от 30 отрицателни серума).
3.2.2. Пробите, показали стойност, по-ниска от
тази, се смятат за отрицателни.
3.2.3. При по-големи стойностти от cut-off +
0,15 се считат за положителни.
3.2.4. Пробите, показали лъжливо положител-
ни резултати, се подлагат отново на изследване за
потвърждаване на резултатите
4. Полимеразно верижна реакция
PCR тестът е специфичен за доказване на ви-
русния РНК на АЧК. Праймерите кореспондират
с 5’ края / нуклеотиди 1-21/ и в 3’ края / нуклеотиди
1160-1179/ от сегмент 8 от РНК на вируса.
Извършване на теста:
От далачна суспензия се екстрахира нуклеино-
вата киселина, както следва: 1 г от пробата се хо-
могенизира в 1 мл от денатуриращ разтвор (4 М
guanidium thiocyanate, 25 mM sodium citrate, 0,1 M
2-mercaptoethanol, 0,5 % sarcosyl), след което се
извършва центрофугиране. Към супернатанта се
прибавят 1 µg чиста РНК, 0,1 ml of 2 M sodium acetate
pH 4, 1 ml phenol and 0,2 ml chloroform/isoamyl alcohol
mixture (49/1), като получената смес внимателно
се разбърква в продължение на 15 мин. в баня от
лед. Следва отделяне на преципитираната РНК на
вируса след фенолна екстракция и преципитация с
алкохол. Методът на ДНК синтезата и PCR ампли-
фикацията се прилага при 37°C. Секвенциите на
PCR праймерите използват последователност
5' GTTAAAATTCGGTTAGGATG 3', която винаги
кореспондира с поляритета на добавената РНК.
Анализът на получения резултат чрез PCR се из-
вършва посредством електрофореза с 1,2 % агара-
зен гел, съдържащ ethidium bromide.
5. Серологични тестове
Индиректният вариант на ЕЛАЙЗА, използващ
разтворим вирус на АЧК или рекомбиниран VP7
протеин за доказване на антитела, се прилага дос-
та често. Имуноблотинг тестът също е адаптиран
за доказване на антитела срещу вируса на АЧК.
Напоследък приложение намери и ЕЛАЙЗА, из-
ползваща неструктурния протеин NS3 за антиген,
като тази реакция може да служи при разгранича-
ването на ваксинирани от инфектирани животни.
РСК се прилага повсеместно, но при някои серуми
не се наблюдава антикомплементарна активност.
5.1. Сравнителна ЕЛАЙЗА за доказване на ан-
титела срещу вируса на африканската чума по
конете
Сравнителната ЕЛАЙЗА се използва за доказва-
не на антитела срещу вируса на АЧК в серуми от
различни видове и категории еднокопитни. Прин-
ципът на реакцията се състои в компететивно свър-
зване на антитела срещу вируса на АЧК. Така реак-
цията, която протича между антигена и антителата
от антиморскосвински серум, се променя при доба-
вяне на серумна проба с наличие на антитела срещу
вируса, което визуално се отразява в промяна на оц-
ветяването след прибавяне на ензим. Изследваните
серуми могат да бъдат тестирани при единично раз-
реждане 1:5 или да бъдат титрирани за установяване
на крайното разреждане. Стойности, по-високи от
50 %, могат да се считат за положителни. Този ме-
тод се използва в регионалната референтна лабора-
тория за АЧК в Пърбрайт, Великобритания.
Извършване на теста
5.1.1. Подготовка на плаките
5.1.1.1. Плаките за ЕЛАЙЗА се натоварват с
100 µl на ямка антиген на вируса АЧК, екстрахи-
ран от клетъчно културална течност и разреден в
карбонатно-бикарбонатен буфер с рН 9,6, за една
нощ при 4 °С.