Държавен вестник, бр. 68, 2014 г., стр. 39

БРОЙ  68	
Д Ъ Р Ж А В Е Н  В Е С Т Н И К 	
СТР.  39  
3.1. Етанол, безводен.
3.2. Ацетон.
3.3. Етанол, 96 % (V/V).
3.4. Амонячен разтвор, 25 % (d4
20=0,91).
3.5. L(+)-аскорбинова киселина.
3.6. Хлороформ.
3.7. Циклохексан.
3.8. Азот, технически.
3.9. Толуен.
3.10. Бензен.
3.11. н-бутанол.
3.12. Бутан-2-ол.
3.13. Хипофосфорна киселина, 50 % (V/V).
3.14. Диазо реагент:
3.14.1. 3-нитро-1-бензендиазониев хлоробен­
зенсулфонат (стабилизирана сол)
3.14.2. 2-хлоро-4-нитро-1-бензендиазониев 
нафталенбензоат (стабилизирана сол)
3.15. Сребърен нитрат.
3.16. п-диметиламинобензалдехид.
3.17. 2,5-диметилфенол.
3.18. Ферихлорид хексахидрат.
3.19. Солна киселина, 10 % (V/V).
3.20. Стандартни субстанции.
Стандартнитe субстанции са посочени в т. 1 
Област на приложение.
При аминосъединенията стандартната суб­
станция трябва да бъде или хидрохлорид (моно- 
или ди-), или свободна основа.
3.21. Стандартни разтвори, 0,5 % (M/V).
Приготвя се 0,5 % (M/V) разтвор на всяка 
стандартна субстанция (т. 3.20).
Претеглят се 50 mg ± 1 mg от стандартната 
субстанция в мерителна колба от 10 cm3 (ml).
Добавят се 5 cm3 (ml) 96 % етанол (т. 3.3) и 
250 mg аскорбинова киселина (т. 3.5).
Разтворът се алкализира с амонячен разтвор 
(т. 3.4) до рН 10 (тест с индикаторна хартия).
Долива се до 10 cm3 (ml) с 96 % етанол (т. 3.3) 
и се разбърква.
Разтворите могат да се съхраняват до една 
седмица на студено и тъмно място.
В някои случаи след добавянето на аскорби­
нова киселина и амоняк може да се образува 
утайка.
Преди работа тези разтвори се оставят да 
се утаят.
3.22. Системи разтворители за хроматографско 
разделяне (подвижни фази).
3.22.1. Ацетон : хлороформ : толуен = 35 : 
25 : 40 (V/V/V).
3.22.2. Хлороформ : циклохексан : абсолютен 
етилов алкохол : 25 % амоняк = 80 : 10 : 10 : 1 
(V/V/V/V).
3.22.3. Бензен : бутан – 2-ол : вода = 50 : 25 : 
25 (V/V/V).
Разклаща се добре след разделяне при стай­
на температура (20 °C до 25 °С) и се използва 
горната фаза.
3.22.4. н-бутанол : хлороформ : реагент М = 
7 : 70 : 23 (V/V/V).
Разделя се внимателно при стайна темпера­
тура (20 °С до 25 °С) и се използва долната фаза.
Реагент М:
Амонячен разтвор, 25 % (V/V) – 24 обемни 
части
Хипофосфорна киселина, 50 % (т. 3.13) – 1 
обемна част
Вода – 75 обемни части
Забележка. Подвижните фази, съдържащи 
амоняк, трябва да се разклащат непосредствено 
преди употреба.
3.23. Индикаторни спрейове (проявяващи 
реактиви).
3.23.1. Diaso реагент.
От избрания реагент (т. 3.14) се приготвя не­
посредствено преди употреба 5 % (M/V) воден 
разтвор.
3.23.2. Реагент на Ehrlich.
Разтварят се 2,0 g п-диметиламинобензалдехид 
(т. 3.16) в 100 cm3 (ml) воден разтвор на солна 
киселина 10 % (M/V) (3.19).
3.23.3. 2,5-диметилфенол-ферихлорид хекса­
хидрат.
Разтвор 1: Разтваря се 1,0 g диметилфенол 
(т. 3.17) в 100 cm3 (ml) 96 % етанол (т. 3.3).
Разтвор 2: Разтварят се 4,0 g ферихлорид 
хексахидрат (т. 3.18) в 100 cm3 (ml) 96 % етанол 
(т. 3.3).
За проявяване хроматограмата се пръска 
последователно с разтвор 1 и после с разтвор 2.
3.23.4. Сребърен нитрат – амонячен разтвор
Към 5 % (M/V) воден разтвор на сребърен 
нитрат (т. 3.15) се добавя 25 % амоняк (т. 3.4), 
докато утайката се разтвори. Приготвя се не­
посредствено преди употреба. Остатъкът от 
разтвора се изхвърля.
4. Апаратура
4.1. Стандартна апаратура за тънкослойна 
хроматография.
4.1.1. Пластмасов или стъклен капак с кон­
струкция, която осигурява хроматографската 
плака да е в азотна атмосфера при проявяване 
и сушене на петната. Тази предпазна мярка е 
необходима поради податливостта на някои 
багрила към окисление.
4.1.2. Микроспринцовка от 10 µl, градуира­
на през 0,2 µl, с игла с квадратно сечение или 
препоръчително дозаторно устройство от 50 µl, 
монтирано върху скобата на статива, така че 
плаката да бъде под азот.
4.1.3. Тънкослойни силикагелни плаки 
20х20 сm с дебелина на слоя 0,25 mm (Macherey 
and Nagel, Silica g-HR или еквивалентни).
4.2. Центрофуга, 4000 rpm. 
4.3. Центрофужни епруветки, 10 cm3 (ml), с по­
лиетиленови капачки на винт или еквивалентни.
5. Процедура
5.1. Подготовка на пробите
При изстискване на тубата първите 2 – 3 cm 
се отстраняват. В центрофужна епруветка (т. 4.3), 
предварително продухана с азот, се поставят 
300 mg аскорбинова киселина и 3,0 g кремооб­
разна или хомогенизирана течна боя. Добавя се 
25 % амоняк (т. 3.4) на капки до рН 10. Долива 
се до 10 cm3 (ml) с 96 % етанол (т. 3.3), хомо­
генизира се под азот (т. 3.8), центрофугира се 
10 min при 4000 rpm. Изследва се горният слой 
на течната фаза.
5.2. Хроматографски анализ
5.2.1. Нанасяне на разтворите върху плаките