Държавен вестник, бр. 67, 2010 г., стр. 62

СТР.  62	
Д Ъ Р Ж А В Е Н  В Е С Т Н И К 	
БРОЙ  67
7. Аналитични принципи за извършване на 
ДНК изследвания за медицински цели 
7.1. Методите трябва да са разработени и 
валидизирани в лабораторията. Използват се 
комбинации от реактиви, които могат да бъдат 
доставени от различни производители. Всяка 
лаборатория определя специфичните характе­
ристики за дадения генетичен анализ съобразно 
изследваната популация от пациенти. Анали­
тичната и клинична валидизация на анализа 
се извършва и документира от лабораторията. 
7.2. Изследванията, използващи готови 
търговски набори, са изцяло осигурени от 
конкретния производител.
7.3. Всички търговски набори, използвани 
за диагностични цели, трябва да съдържат 
информация за чувствителност, специфичност 
и надеждност на използвания анализ за кон­
кретната диагностика и СЕ марка. 
8. Подходи за молекулярно-генетични анализи 
за диагностични цели
8.1. Директният ДНК анализ за диагностични 
цели при заболявания с висока алелна хетеро­
генност трябва да позволява откриването на 
не по-малко от 80 % на молекулните дефекти, 
свързани с конкретното заболяване.
8.1.1. Известните молекулни дефекти са 
тези, за които има данни в HUGO MUTATION 
DATABASE. Всички методи, използвани за 
търсене на известни мутации, трябва да поз­
воляват категоричното доказване на конкретен 
молекулен дефект. За това е необходимо из­
ползването на съответните референтни контроли 
(специфични мутации в хомо- и хетерозиготно 
състояние и нормална контрола).
8.1.2. Новооткритите секвенционни вариан­
ти, за които няма данни в HUGO MUTATION 
DATABASE, се приемат за молекулни дефекти, 
имащи отношение към определена патология, 
ако: е доказана косегрегацията с изследвано­
то заболяване в семейството; мутацията не е 
открита в изследвана контролна група лица, 
доказано здрави по отношение на изследваната 
патология (Броят на лицата в контролната група 
зависи от честотата на заболяването. Например 
за заболявания с честота 1:10 000 се изследват 
минимум 100 здрави индивида.); мутацията е 
доказана в два независими амплификационни 
продукта; доказана е връзката є с патологията 
чрез експресионен анализ; променят еволюци­
онно консервативна аминокиселина.
8.2. Индиректен подход е този, при който 
в изследваното семейство се проследява ко­
сегрегацията на заболяването с полиморфни 
маркери от болестния локус.
9. Общи аналитични изисквания към диагнос­
тичните ДНК методи
9.1. За диагностични цели могат да се из­
ползват следните биологични материали:
9.1.1. Кръвни проби с обем не по-малък от 2 
милилитра в епруветки с EDTA антикоагулант. 
Кръвните проби могат да бъдат съхранявани 
и транспортирани не повече от 48 часа при 
температура 4° – 8° С. Съсирени кръвни проби 
не подлежат на анализ. 
9.1.2. Амниотична течност – минимум 5 
милилитра. Амниотичната течност може да 
бъде съхранявана и транспортирана не повече 
от 48 часа при температура 4° – 8° C. Амнио­
тична течност с примес на кръв не подлежи 
на ДНК анализ. 
9.1.3. Култивирани клетки – минимум 1×106 
клетки. Те трябва да бъдат съхранявани и транс­
портирани в стерилна среда, при температура 
4° – 8° C за не повече от 48 часа. 
9.1.4. Некултивирани клетки (букална лига­
вица, цервикални, уретрални и др.) се взимат 
и транспортират съгласно указанията на кон­
кретната лаборатория. 
9.1.5. Тъканен материал – минимум 5 ми­
лиграма. Хорионните въси трябва да бъдат 
предварително очистени от децидуа. Те трябва 
да бъдат съхранявани и транспортирани в 
стерилна среда или физиологичен разтвор при 
температура 4° – 8° C за не повече от 48 часа. 
Фиксирани тъкани са приложими за анализ 
само в определени случаи, посочени от кон­
кретната лаборатория. 
9.1.6. Кръв, накапана върху специална фил­
търна бланка (от масовия неонатален скрининг).
9.2. Изолирането на ДНК/РНК от биологи­
чен материал трябва да бъде извършвано със 
стандартизирани методики на базата на публи­
куваните в литературата данни или следвайки 
инструкциите на производителя при използва­
нето на готови набори. 
9.3. Количеството на ДНК/РНК трябва да 
бъде измерено спектрофотометрично. Изолира­
ната ДНК трябва да бъде съхранявана на -20° С 
(за ДНК банка при -70° С) под 96 % етилов 
алкохол или разтворена в специален буфер. 
Работните количества трябва да бъдат съхра­
нявани на температури не по-високи от 4° C.
10. Изисквания към контролните материали
10.1. Подбор и приготвяне на контроли. В 
рамките на едно изследване основно се използ­
ват: (А) отрицателни контроли, (Б) положителни 
контроли, (В) контроли за диагностични марке­
ри, (Г) контроли за определяне на молекулния 
размер на изследваните проби. 
10.2. Точната нуклеотидна последователност 
на използваните ДНК сонди или зародиши 
(праймери) трябва да бъде документирана по 
изискванията на геномнитe бази данни или 
публикации в специализираната литература. 
Синтетичните олигонуклеотиди трябва да бъдат 
съпроводени с пълна техническа информация 
от страна на производителя.
11. Полимеразно-верижна реакция (PCR)
11.1. Препоръчително е използването на 
физични и/или биохимични бариери за пре­
дотвратяване на ДНК контаминация. Преам­
плифкационните процедури трябва да бъдат 
извършвани в помещение за подготовка на