Държавен вестник, бр. 6, 2006 г., стр. 13

Б Р О Й  6
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
С Т Р .  13
5. Серологични тестове
Индиректният вариант на ЕЛАЙЗА, използ-
ващ разтворим вирус на АЧК или рекомбиниран
VP7 протеин за доказване на антитела, се прила-
га доста често. Имуноблотинг тестът също е адап-
тиран за доказване на антитела срещу вируса на
АЧК. Напоследък приложение намери и ЕЛАЙ-
ЗА, използваща неструктурния протеин NS3 за
антиген, като тази реакция може да служи при
разграничаването на ваксинирани от инфекти-
рани животни. РСК се прилага повсеместно, но
при някои серуми не се наблюдава антикомпле-
ментарна активност.
5.1. Сравнителна ЕЛАЙЗА за доказване на ан-
титела срещу вируса на африканската чума по
конете
Сравнителната ЕЛАЙЗА се използва за доказ-
ване на антитела срещу вируса на АЧК в серуми от
различни видове и категории еднокопитни. Прин-
ципът на реакцията се състои в компететивно свър-
зване на антитела срещу вируса на АЧК. Така ре-
акцията, която протича между антигена и антите-
лата от антиморскосвински серум, се променя при
добавяне на серумна проба с наличие на антитела
срещу вируса, което визуално се отразява в промя-
на на оцветяването след прибавяне на ензим. Из-
следваните серуми могат да бъдат тестирани при
единично разреждане 1:5 или да бъдат титрирани
за установяване на крайното разреждане. Стойнос-
ти, по-високи от 50 %, могат да се считат за поло-
жителни. Този метод се използва в регионалната
референтна лаборатория за АЧК в Пърбрайт, Ве-
ликобритания.
Извършване на теста
5.1.1. Подготовка на плаките
5.1.1.1. Плаките за ЕЛАЙЗА се натоварват с
100 ml на ямка антиген на вируса АЧК, екстрахи-
ран от клетъчно културална течност и разреден в
карбонатно-бикарбонатен буфер с рН 9,6, за една
нощ при 4 °С.
5.1.1.2. Плаките се промиват трикратно с PBS с
рН 7,2—7,4, след което се подсушават.
5.1.2. Контролни ямки на плаките
5.1.2.1. Положителните контролни серуми се
титрират в двойна серия разреждане, започващи
от 1:5 до 1:640, в колона 1 в блокиращ буфер (PBS
+ 5 % обезмаслено сухо мляко Cadbury’s Marvel
TM + 0,05 % w/v Tween 20 и 1 % ГСА) до получа-
ване на 50 ml на ямка.
5.1.2.2. Към ямки А и В от колона 2 се добавя
50 ml от отрицателния серум при разреждане 1:5
(10 ml серум + 40 ml блокиращ буфер).
5.1.2.3. В ямки С и D от колона 2 (празна) се
добавя 100 ml на ямка блокиращ буфер.
5.1.2.4. В ямки E, F, G и H от колона 2 се накап-
ва 50 ml блокиращ буфер.
5.1.3. Метод за единична титрация:
Прибавя се в разреждане 1:5 серум в блокиращ
буфер в колоните от 3 до12 (10 ml серуми + 40 ml
блокиращ буфер).
Или:
5.1.4. Метод на титрацията:
Приготвят се двойни серийни разреждания от
1:5 до 1:640 в блокиращ буфер в осем ямки от еди-
нични колони (3 до 12).
След което:
5.1.5. Добавят се 50 ml антисерум от морско свин-
че, предварително разреден в блокиращ буфер във
всички ямки на плаката с изключение на празните
(така навсякъде количеството е 100 ml на ямка).
5.1.5.1. Плаките се инкубират за 1 час при 37 °С
върху орбитален шейкър.
5.1.5.2. Плаките се промиват трикратно, след
което се подсушават.
5.1.5.3. Към всяка ямка се прибавя 50 ml коню-
гат: заешкиантиморскосвински пероксидаза, пред-
варително разтворен в блокиращ буфер.
5.1.5.4. Инкубира се в продължение на 1 час при
37 °С върху орбитален шейкър.
5.1.5.5. Плаките се промиват трикратно и се
подсушават.
5.1.6. Хромоген
Ортофенилендиаминовият разтвор се пригот-
вя според инструкциите (0,4 мг/мл в стерилна
дестилирана вода) непосредствено преди упот-
реба. Добавя се субстрат водороден прекис до
крайна концентрация 0,05 % v/v (1 към 2000 на
30 % разтвор на Н2О2 ). Във всяка ямка се накап-
ва по 50 ml от Орто фенилен диамин разтвора, като
след 10-минутен престой на стайна температура
реакцията се спира чрез прибавяне на ямка 50 ml
1М H2 SO4.
5.1.7. Отчитане
Извършва се на ЕЛАЙЗА ридър при дължина
на вълната 492 nm.
5.1.8. Интерпретиране на резултатите
5.1.8.1. С помощта на софтуерна програма се
отчитат резултатите от оптичната плътност. За
валидиране на теста е необходимо горната грани-
ца и долната контролна граница на серума от мор-
ско свинче да са между 1,4 и 0,4. Крайният титър
за положителния контролен серум, базиран на
50 %, трябва да бъде 1:240 в граници от 1:120 до
1:480. Всяка плака, която не отговаря на стандар-
та, трябва да се изхвърли. Въпреки това, ако при
отрицателните серуми титърът е 1:480 и нагоре,
те могат да се приемат за отрицателни. Двойните
серумни ямки на отрицателната контрола и праз-
ните трябва да дават стойности съответно между
+ 25 % и—25 % и между + 95 % и + 105 %. При
положение че стойностите са извън тези грани-
ци, това не означава, че плаката е невалидна, а е
признак за оцветяване.
5.1.8.2. Проби, даващи инхибиция повече от
50 %, се считат за положителни. Проби, при от-
читането на които стойностите са под 50 %, се
считат за отрицателни. При двойните проби, при
които се установяват стойности от различните
кладенчета под и над 50 %, се считат за съмни-
телни. Обикновено тези проби се подлагат на
повторно изследване. Положителните проби също
могат да се титрират с цел да се установи степен-
та на положителност.