Държавен вестник, бр. 109, 2002 г., стр. 37

Б Р О Й  109
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
С Т Р .  37
4.2. Разтвор на фосфатен буфер с рН 8:
монокалиев фосфат, KH2PO4, ч.з.а.—0,523 g;
дикалиев фосфат, K2HPO4.2H2O, ч.з.а.—
16,730 g;
дестилирана вода—до 1000 ml.
4.3. Разтвор на фосфатен буфер с рН 7:
монокалиев фосфат, KH2PO4, ч.з.а.—5,5 g;
дикалиев фосфат, K2HPO4.2H2O, ч.з.а.—
13,6 g;
дестилирана вода—до 1000 ml.
4.4. Стерилен физиологичен разтвор.
4.5. Чист метанол.
4.6. 40%-ен (о/о) метанол.
4.7. Смес от разтвор на фосфатен буфер (4.2)
и чист метанол в съотношение 60/40 по обем.
4.8. Стандартна субстанция: тилозин с из-
вестна активност.
5. Стандартни разтвори
Стандартната субстанция (4.8) се суши в
продължение на 3 h при 60°C във вакуумна су-
шилня (5 mm Hg стълб). Претеглят се от 10 до
50 mg в мерителна колба, разтварят в 5 ml мета-
нол (4.5) и се разрежда с разтвора на фосфатния
буфер, рН 7 (4.3), така че да се получи основна
концентрация на тилозина 1000 µg/ml.
От този резервен разтвор чрез разреждане
със сместа (4.7) се приготвя стандартен рабо-
тен разтвор S8, съдържащ 2 µg/ml тилозин—
основа.
Като се използва сместа (4.7), чрез серийни
разреждания (1+1) се приготвят следните кон-
центрации:
S4 —1 µg/ml;
S2 —0,5 µg/ml;
S1 —0,25 µg/ml.
6. Екстракция
За концентратите се взема проба от 10 g; за
премиксите и за продуктите за изхранване на
животни—20 g. Добавят се 60 ml разтвор на
фосфатен буфер рН 8 (4.2), предварително наг-
рят до 80°C, и се хомогенизира в продължение
на 2 min (домашен миксер, Ultra-turrax и др.).
Оставя се в продължение на 10 min, добавят
се 40 ml метанол и се хомогенизира в продълже-
ние на 5 min.
Екстрактът се центрофугира, аликвотна част
се разрежда със сместа (4.7), за да се получи
предполагаема концентрация на тилозина 2 µg/
ml (= U8). След това чрез серийни разреждания
(1+1), като се използва сместа (4.7), се пригот-
вят концентрациите U4, U2 и U1.
При съдържание по-малко от 10 ppm екст-
рактът се изпарява до сухо на ротационен изпа-
рител при 35°C и остатъкът се разтваря в 40%-
ен метанол (4.6).
7. Метод за определяне
7.1. Инокулиране на хранителната среда
Основната среда за определянето (4.1), ко-
ригирана до рН 8, се инокулира с бактериална-
та суспенсия (3.2.) при температура от 48 до 50°C.
7.2. Подготовка на паничките
Дифузията в агар се провежда в панички, като
се използват четири концентрации на стандар-
тния разтвор (S8, S4, S2, S1) и четири концентра-
ции на екстракта (U8, U4, U2, U1). Във всяка
паничка трябва да бъдат разположени четири-
те концентрации на стандартния разтвор и на
екстракта.
За тази цел се избират достатъчно големи
панички, така че в агаровата среда да могат да
бъдат направени най-малко 8 кладенчета с ди-
аметър от 10 до 13 mm. Пресмята се количес-
твото на инокулираната хранителна среда (7.1)
да бъде такова, че да осигури равномерен слой
с дебелина 2 mm. За предпочитане е изследва-
нето да се провежда в съдчета, състоящи се от
стъклена плочка със съвършено пасващ пла-
стмасов или алуминиев пръстен с диаметър
200 mm и височина 20 mm.
В зависимост от диаметъра на кладенчетата
в тях се нанася с пипета точно премерено коли-
чество (между 0,10 и 0,15 ml) от разтвора на
антибиотика.
За всяка проба разрежданията се повтарят
най-малко 4 пъти с всяка концентрация, така
че всяко определяне да включва оценяването
на 32 зони на инхибиране.
7.3. Инкубиране
Паничките се инкубират в продължение на
24 h при 35 до 37°C.
8. Оценяване
За предпочитане е диаметърът на зоните на
инхибиране да се измери чрез прожектиране.
Измерванията се нанасят върху полулогарит-
мична хартия, като се нанасят стойностите на
логаритъма на концентрациите срещу стойнос-
тите за диаметъра на зоните на инхибиране.
Начертават се линиите на стандартния разтвор
и на екстракта. При условие, че няма странич-
ни ефекти, двете линии трябва да бъдат успо-
редни.
Логаритъмът на относителната активност се
пресмята, като се използва следната формула:
(U1 +U2+ U4+U8— S1—S2—S4—S8) 0,602
––––––––––––––––––––––––
U4+U8+S4+S8—U1—U2—S1—S2
Реалната активност е равна на предполага-
емата активност, умножена по относителната
активност.
9. Повторяемост
Разликата между резултатите от две пара-
лелни определяния, проведени с една и съща
проба, не трябва да надвишават 10% като отно-
сителна стойност.
ХХVII. Определяне на виржиниамицин чрез
дифузия в агар
1. Цел и обхват
Този метод дава възможност за определяне
съдържанието на виржиниамицин в продукти за
изхранване на животни, концентрати и премик-
си, когато количеството му е повече от 2 ppm.
2. Принцип