Държавен вестник, бр. 27, 2007 г., стр. 22

С Т Р .  22
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  27
5.2.8. Отстранете покривните стъкла от препа-
ратите и ги поставете в кутия за препарати.
5.2.9. Отмийте излишната проба чрез инкуба-
ция за 15 min в стъкленица с 1x хибмикс при 55 °C.
5.2.10. Преместете кутията за препарати в 1/2
хибмикс разтвор за измиване и инкубирайте за
още 15 min.
5.2.11. Потопете стъклата за кратко в ултра-
чиста вода и ги поставете върху филтърна хартия.
Отстранете излишната влага чрез внимателно
покриване на повърхността с филтърна хартия.
Пипетирайте 5 до 10 µl от разтвора на увеличите-
ля против избледняване (напр. Vectashield, Vecta
Laboratories, CA, USA или еквивалентен) върху
всяко прозорче и поставете голямо покривно стък-
ло (24 Ч 60 mm) върху целия препарат.
5.3. Тълкуване на FISH теста
5.3.1. Наблюдавайте препаратите веднага с
микроскоп, пригоден за епифлуоресцентна мик-
роскопия при 630 до 1000x увеличение под имер-
сионно масло. С филтър, подходящ за флуоресце-
ин изотиоцианат (FITC), еубактериалните клет-
ки (включително повечето грам-отрицателни
клетки) в пробата се оцветяват във флуоресцент-
но зелено. Използвайки филтър за тетраметил-
родамин-5-изотиоцианат, Cy3-оцветените клетки
на C. m. subsp. sepedonicus се наблюдават като флу-
оресцентно червени. Сравнете морфологията на
клетките с тази на положителните контроли.
Клетките трябва да са ярко флуоресциращи и
напълно оцветени. Тестът FISH (раздел 9.4) трябва
да бъде повторен, ако оцветяването е анормално.
Сканирайте прозорчетата напречно през двата
диаметъра при десните ъгли и по периметъра. За
проби без или с малък брой клетки наблюдавайте
поне 40 микроскопски полета.
5.3.2. Наблюдавайте за ярко флуоресциращи
клетки с характерна за C. m. subsp. sepedonicus мор-
фология в прозорчетата на тестовите стъкла (виж
интернет страницата http://forum.europa.eu.int/Public/
irc/sanco/Home/main). Интензивността на флуорес-
ценцията трябва да бъде еквивалентна или по-доб-
ра от тази на щама на положителната контрола.
Клетки с непълно оцветяване или слаба флуорес-
ценция не трябва да бъдат отчитани.
5.3.3. Ако се предполага някакво заразяване,
тестът трябва да бъде повторен. Това може да бъде
случай, при който всички стъкла от една серия
показват положителни клетки поради замърсява-
не на буфера или ако се намират положителни
клетки (извън прозорчетата на препарата) по пок-
ривния слой на предметното стъкло.
5.3.4. Има няколко проблема, присъщи на спе-
цифичността на FISH теста. Възможно е съпътст-
ващи популации от флуоресциращи клетки с ати-
пична морфология и кръстосани реакции със сап-
рофитни бактерии, чиито размер и морфология са
подобни на C. m. sepedonicus, да се намерят в утай-
ките от конуси и стъблени части макар и по-рядко,
отколкото при имунофлуоресцентния тест.
5.3.5. Отчитайте само флуоресциращи клетки с
типичен размер и морфология, вижте 5.3.2.
5.3.6. Тълкуване на резултатите от FISH теста:
а) Валидни резултати от FISH теста се получа-
ват, ако се наблюдават ярко зелени флуоресцира-
щи клетки с размер и морфология, типични за C. m.
subsp. sepedonicus, използвайки FITC филтър и ярко
оцветени в червено флуоресциращи клетки, използ-
вайки родаминов филтър във всички положител-
ни контроли и в нито една от отрицателните кон-
троли. Ако се открият ярко флуоресциращи клет-
ки с типична морфология, пресметнете средния
брой типични клетки на микроскопско поле и из-
числете броя на типични клетки на ml от ресуспен-
дирана утайка (Допълнение 4). Проби с поне 5 Ч 103
типични клетки на ml от ресуспендирана утайка се
считат за потенциално заразени. Изисква се по-
нататъшно тестване.
Пробите с по-малко от 5  Ч 103 типични клетки
на ml от ресуспендирана утайка се считат за отри-
цателни.
б) FISH тестът е отрицателен, ако не се наблю-
дават ярко оцветени в червено флуоресциращи
клетки с размер и морфология, типични за C. m.
subsp. sepedonicus, използвайки родаминов филтър,
при условие че типични ярко оцветени в червено
флуоресциращи клетки се наблюдават във всички
стъкла с положителни контроли, като се използва
родаминов филтър.
6. PCR тест
Принципи
Когато се използва PCR тест като основен скри-
нингов тест и той даде положителни резултати,
трябва да се извърши имунофлуоресцентен тест
като втори задължителен скринингов тест. Кога-
то се използва PCR тест като втори скринингов
тест и той даде положителни резултати, се изиск-
ва по-нататъшно тестване според диаграмата, за
да се завърши диагностиката.
Пълното използване на този метод като ос-
новен скринингов тест се препоръчва само кога-
то са натрупани необходимите експертни знания
и умения.
Забележка.
Предварително тестване с този метод би трябва-
ло да позволи продуктивно откриване на 103 до 104
клетки от C. m. subsp. sepedonicus на ml, прибавен
към екстрактите от пробата, които преди това са
дали отрицателни резултати. Може да се наложат
опити за оптимизиране, за да се постигнат макси-
малните нива на чувствителност и специфичност във
всички лаборатории. Използвайте валидирани ре-
активи и протоколи за PCR. Препоръчително е да
изберете метод с вътрешен контрол.
Използвайте подходящи предпазни мерки, за
да избегнете замърсяване на пробата с целева ДНК.
PCR тестът трябва да се извършва от опитни лабо-
ранти в специализирани лаборатории по молеку-
лярна биология с оглед да се минимизира възмож-
ността от заразяване с целева ДНК.
Отрицателните контроли (за ДНК екстракция
и PCR процедури) трябва винаги да бъдат третира-
ни като крайни проби в процедурата, за да стане
ясно дали е станало някакво пренасяне на ДНК.
В PCR теста трябва да бъдат включени следни-
те отрицателни контроли:
— екстракт от пробата, която преди това е по-
казала отрицателни резултати за C. m. subsp.
sepedonicus,
— буферни контроли, използвани за екстрак-
ция на бактерията и ДНК от пробата,
— реакционна смес за PCR.