Държавен вестник, бр. 17, 2004 г., стр. 28

С Т Р .  28
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  17
6. инкубатор;
7. криостатен микротом;
8. флуоресцентен микроскоп;
9. светлинен микроскоп;
10. охлаждаща центрофуга;
11. ултрацентрофуга;
12. бидестилатор;
13. двупроходен автоклав;
14. перална машина със сушилня и ютия;
15. общо лабораторно оборудване: везни, рН метър,
миксер, водна баня, многоканални и едноканални пи-
пети с обем от 10 µl до 1000 µl и съответни еднократни
наконечници, еднократна посуда за рутинни вирусоло-
гични изследвания и поддържане на клетъчни култури,
хранителни среди и реактиви;
16. ELISA система: инкубатор, миещо устройство,
рийдер за спектрофотометрично отчитане на плаки,
компютър със съответен софтуер и принтер;
17. PCR оборудване.
6. Вирусни щамове
Всички изолати на вируса на АЧС се съхраняват
дълбоко замразени в заключен фризер, който не се из-
ползва за съхраняване на други вируси и материали,
несвързани с диагностиката на АЧС. Използват се ин-
дивидуални ампули, щателно номерирани, с етикет.
Води се стриктна конфиденциална документация за ви-
русните щамове: произход, дати и резултати от конт-
ролните изследвания в лабораторията, както и резулта-
тите от генетичното типизиране на Референтната лабо-
ратория на Европейския съюз.
7. Опитни животни
Използването на опитни животни не се препоръчва.
В случай на крайна необходимост с изричното писмено
разрешение на генералния директор на НВМС се допус-
ка провеждането на биологичен опит в биообезопасено
звено в рамките на лабораторията за АЧС при строги
мерки за сигурност, денонощна охрана и с участието само
на персонала на лабораторията. Всички опитни животни
се унищожават в рамките на звеното след приключване
на опита, труповете се обезвреждат и изгарят.
III. Диагностични методи
1. Доказване на вируса
1.1. Проби и подготовка на пробите за изследване.
При подозрение за АЧС в референтната за страна-
та лаборатория се изпращат следните проби: кръв в
антикоагулант (хепарин или етилен диамин тетра-
оцетна киселина (EDTA)), далак, тонзили, бъбреци,
лимфни възли. Пробите по време на транспорта се
съхраняват колкото се може по-добре охладени, без да
се замразяват.
За провеждане на реакция хемадсорбция и инокула-
ция на прасета от тъканите се изготвя суспензия чрез
нарязване на малки парченца и стриване в хаван или с
помощта на тъканен хомогенизатор. След това се доба-
вя 5—10 ml буфериран солеви разтвор или среда за кле-
тъчни култури, съдържащи антибиотици. Суспензиите
се пречистват чрез центрофугиране при 1000 g за 5 min.
За постановка на реакция хемадсорбция и за инокула-
ция на прасета се използва супернатантата.
1.2. Реакция хемадсорбция (HT).
Тестът е основен и определящ за АЧС поради фак-
та, че свинските еритроцити адхезират по повърхност-
та на свински моноцити или макрофаги, заразени с
вируса на АЧС, като повечето изолати на този вирус
предизвикват феномена хемадсорбция. Изолирани са
много малко нехемадсорбиращи вируси, повечето от
които са авирулентни, но някои могат да причинят
типична акутна форма на болестта.
Реакцията се провежда чрез заразяване на първич-
ни левкоцитни култури с кръв или тъканни суспензии
от съмнително болни прасета (процедура 1) или чрез
изготвяне на левкоцитни култури от кръв на заразени в
лабораторията прасета или такава от съмнително бол-
ни прасета на терена (процедура 2). От 100 ml събрана
дефибринирана или хепаринизирана кръв могат да се
приготвят до 300 култури. Основно правило е всички
процедури да се извършат по начин, предпазващ от
контаминиране на културите.
Процедура 1. HT в първични левкоцитни култури
Прясна кръв от прасе се обработва с хепарин
(100 IU/ml кръв), центрофугира се при 700 g за 30 min,
левкоцитите се изваждат, промиват се със среда,
ресуспендират се до концентрация от 107 клетки/ml в сре-
да за клетъчни култури, съдържаща 10—30 % свински
серум и антибиотици. За избягване на неспецифична хе-
мадсорбция средата трябва да съдържа серум или плазма
от същото прасе, от което са добити левкоцитите.
Клетъчната суспензия се разлива в епруветки
160 Ч 16 mm в равно количество от 1,5 ml, които се ин-
кубират в положение 5—10 °С към хоризонталата при
37 °С. Достатъчно чувствителни към вируса за рутинна
диагностика са културите на възраст от 2 до 4 дни.
Три от епруветките се заразяват чрез добавяне на
0,2 ml за епруветка от приготвените тъканни проби,
като е препоръчително заразяване да се извърши и с
десетократни и стократни разреждания на пробите—
от особена важност, когато теренният материал е дос-
тавен при лоши условия. Залагат се положителни и от-
рицателни контроли чрез заразяване съответно с хем-
адсорбиращ вирус и без заразяване за разкриване на
възможна неспецифична хемадсорбция.
След 3 дни във всяка една от епруветките се добавя
по 0,2 ml прясно приготвена 1 %-на суспензия от ери-
троцити в буферен разтвор.
В продължение на следващите 7—10 дни културите
се наблюдават ежедневно под микроскоп за наличие на
цитопатичен ефект (ЦПЕ) и на хемадсорбция.
Отчитане на резултатите: Хемадсорбцията се със-
тои в струпване на голямо количество свински еритро-
цити по повърхността на заразените клетки. Цитопа-
тичният ефект се състои в отсъствие на адхезиращи
клетки при отсъствие на хемадсорбция. Вероятните при-
чини за наличието на ЦПЕ са: цитотоксичен ефект на
инокулума, наличие на вируса на Ауески или наличие
на нехемадсорбиращ вирус на АЧС, който обаче може
да бъде доказан чрез DIF или чрез PCR. При отсъствие
на изменения или ако резултатите от DIF и PCR са
отрицателни, наложително е ново заразяване на пресни
левкоцитни култури със супернатантата от старите.
Процедура 2. HT в левкоцитни култури от перифер-
на кръв на заразени прасета
Процедурата е по-лесна от подготовката и инокула-
цията на първични свински левкоцитни култури и дава
по-бързи резултати при положителни случаи. Тя може
да се изпълни в лаборатории, които не са оборудвани за
рутинна вирусологична диагностика: минимални изиск-
вания са наличието на предметни и покривни стъкла,
микроскоп, стерилна среда, епруветки и пипети. Кръв-
та, взета от подозрителни прасета на терена и от таки-
ва, инокулирани в лабораторията, се обработва с хепа-
рин и левкоцитните култури се събират за директно
наблюдение за хемадсорбция.
Вземат се 20 ml от цяла кръв в спринцовка, съдържа-
ща 2000 IU хепарин в 2 ml буферен разтвор, размесват се
и се прехвърлят в стъклена епруветка. Епруветката се
поставя вертикално в инкубатор или във водна баня при
37 °С и се изчаква утаяването на клетките. Седиментаци-
ята се подобрява чрез добавяне на 2 ml разтвор на Дек-
стран 150 в 0,9 % натриев хлорид. Културите се инкуби-
рат за 6—8 часа при 37 °С, след което малки количества
от супернатантата, съдържаща бели кръвни клетки, за-
едно с еритроцити се наблюдават под микроскоп върху
предметно стъкло за наличие на хемадсорбция.
1.3. Доказване на антиген на вируса на АЧС чрез
директен имунофлуоресцентен метод (DIF).
DIF се използва за доказване на антиген на АЧС в
тъкани от подозрителни прасета от терена или на такива,
заразени в лабораторията. Допълнително методът може