Държавен вестник, бр. 6, 2006 г., стр. 16

С Т Р .  16
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  6
в 15 % acrylamide-N,N'-diallytartar-diamide
(DATD) гел. Така разделените протеини се прех-
върлят върху нитроцелулозни мембранни филт-
ри при постоянен ток със сила 280 mA за 6 часа
при 4 °С. Нитроцелулозните мембрани се изряз-
ват и се обработват с тестираните серуми в раз-
реждане 1:20, след това с конюгат, маркиран с
пероксидаза заешки антиконски имуноглобу-
лин—1:500, и се инкубира за 1 час на 37 °С. Оцве-
тяването на бендовете се извършва посредством
4-хлор-нафтол техника.
5.4.2. Интерпретиране на резултатите
Сравняват се бендовете на положителната и
отрицателната контрола с тези на изследваните
серуми. Появата на повече от два бенда показва,
че серумът е положителен за наличие на антитела
срещу вируса на АЧК.
5.5. ЕЛАЙЗА срещу неструктурните протеини
на вируса (NS3 ЕЛАЙЗА)
Тази реакция се използва, за да може да се раз-
личават антитела,получени вследствие на вакси-
нация с AHSV-4, и такива, които са инфектирани
с вирулентен вирус.
5.6. Реакция за свързване на комплемента (РСК)
РСК се използва с оглед установяването на
групово специфични антикомплементални анти-
тела срещу вируса на АЧК. Най-често като анти-
ген се използва захарно-ацетонов екстракт от миши
мозък. При отсъствие на стандартизин серум ан-
тигенът се титрира срещу местен положителен
серум. За контролен антиген служи миши мозък,
получен по същия начин от здрави мишки.
Серумите от коне трябва да бъдат инактиви-
рани на 56 °С, серумите от зебри на 60 °С, а от
магарета на 62 °С за 30 мин. Тестираните серуми
се разреждат 1:10 и се инактивират по посочения
начин. Титрацията на положителните контроли
се извършва в двукратни разреждания. Антиге-
ните—положителен и контролен, се разреждат в
буфер, съдържащ 4—8 антигенни единици във
veronal buffered saline, съдържащ 1 % gelatin
(VBSG);
морскосвинският комплемент се разрежда във
VBSG до 4 CH50 (50 % complement haemolytic
units). Серумите, комплементът и антигенът се
свързват, поставени в 96-ямкови плаки с равно
дъно или в епруветки, поставени на 4 °C за 18
часа. Хемолизинът се разрежда в реакцията до 2
хемолитични единици и се употребява заедно с
промити овчи еритроцити. Еритроцитите се стан-
дартизират до 3 % концентрация и се добавят в
ямките. Реакцията продължава с инкубация за
30 мин на 37 °C. Плаките се центрофугират на
200 g и се отчита наличието на хемолиза. За кон-
троли служат: (а) серум и комплемент (b) серум
и еритроцити (c) антиген и контролен, всеки с 4
CH50, 2 CH50, and 1 CH50 от комплемента (d)
антиген с еритроцити (e) контролен антиген с
еритроцити (f) разреждания на комплемента от
4 CH50, 2 CH50, and 1 CH5 и (g) еритроцити.
Титърът се определя от най-високото разрежда-
не на серум, фиксирано от комплемента с поло-
жителния антиген. Така титър в разреждане от
1/10 се счита за положителен, а под 1/10—за от-
рицателен.
5.7. Реакция вирус неутрализация (ВНР)
ВНР се използва се определяне на серотипа.
Вирусният антиген се разрежда до 30—100
TCID50 (50 % tissue cultureinfective dose) за 25 µl и
25 µl се прибавя във всяка епруветка, съдържаща
25 µl серумни разреждания. При скриингови из-
следвания се използва разреждане на серума до 1:10.
Сместа от серум с вирус се инкубира за 60 ми-
нути при 37 °C преди добавяне на 0,1 ml от VERO
клетъчна суспензия (200 000 клетки/ml) във всяка
епруветка.
При титрация вирусният антиген се приготвя
за тестване на четири разреждания по 25 µl на ямка.
Плаките се инкубират на 37 °C, 5 % CO2, 95 % влаж-
ност за 4—5 дни, при съдържание на вирус 30—100
TCID50.
Плаките се фиксират и оцветяват с разтвор на
0,15 % crystal violet in2 % glutaraldehyde, след което
се промиват.
За 50 % крайна точка на титъра на серума се
изчислява по метода на Spearman-Karber и се оп-
ределя отрицателният log10.
128441
НАРЕДБА № 26
от 14 декември 2005 г.
за сътрудничество между Националната вете-
ринарномедицинска служба, ветеринарните
служби на държавите—членки на Европейския
съюз, и Европейската комисия при прилагане
на ветеринарното законодателство
Чл. 1. (1) С тази наредба се определя редът,
по който Националната ветеринарномедицин-
ска служба (НВМС) осъществява сътрудничес-
тво с ветеринарните служби на държавите—
членки на Европейския съюз, и съответните ад-
министративни структури на Европейската ко-
мисия за прилагане на ветеринарното законо-
дателство в съответствие с изискванията на Ев-
ропейския съюз.
(2) Националната ветеринарномедицинска
служба към Министерството на земеделието и
горите е компетентният орган за осъществява-
не на контрол по прилагането на ветеринарно-
то законодателство.
(3) Министерството на земеделието и гори-
те информира другите държави членки и Евро-
пейската комисия, че НВМС е компетентният
орган за контрол по прилагането на ветеринар-
ното законодателство.