Държавен вестник, бр. 109, 2002 г., стр. 54

С Т Р .  54
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  109
Върху ТСХ блюдото (4.8) на 2 сm от долния
ръб и на разстояния от 2 сm се капват обемите
стандартен разтвор и екстракт, посочени по-долу:
—10, 15, 20, 30 и 40 µl от стандартния разтвор
на Афлатоксин В1 (3.17);
—10 µl  от екстракта, получен в 5.3, и на съ-
щото място отгоре 20 µl от стандартния разт-
вор (3.16);
—10 и 20 µl от екстракта, получен в 5.3.
Хроматограмата се проявява на тъмно с един
от проявителите разтвори (3.18). Изборът на
разтворител трябва да е направен предварител-
но чрез нанасяне на 25 µl от качествения стан-
дартен разтвор (3.17) върху блюдото и след
проявяване—проверка дали Афлатоксин В1 и
В2 са напълно разделени един от друг.
Разтворителите се оставят да се изпарят на
тъмно и след това се облъчват с ултравиолето-
ва светлина, като блюдото се поставя на 10 сm
от лампата (4.9). Петната Афлатоксин В1 дават
синя флуоресценция.
5.5. Количествени определения
Определя се или визуално, или чрез флуоро-
денситометрия.
5.5.1. Визуални измервания
Определя се количеството Афлатоксин В1 в
екстракта, като се сравнява интензитетът на
флуоресценция на петната с екстракт с този на
петната със стандартен разтвор, и се намира на
кое съответства. Интерполира се, ако се нала-
га. Флуоресценцията, получена чрез наслагва-
не на екстракта върху стандартния разтвор, тря-
б-ва да е по-интензивна от тази на 10 µl от екс-
тракта и да има не повече от едно видимо пет-
но. Ако интензитетът на флуоресценция на 20
µl от екстракта е по-голям от този на 40 µl от
стандартния разтвор, екстрактът се разрежда
10 или 100 пъти с хлороформ (3.2) или смес
бензол / ацетонитрил (3.6), преди да се подложи
отново на тънкослойна хроматография.
5.5.2. Измерване чрез флуороденситометрия
Измерва се интензитета на флуоресценция
на петната Афлатоксин В1 с флуороденситоме-
търа (4.12) при дължина на вълната на възбуж-
дане 365 nm и дължина на вълната на излъчва-
не 443 nm. Определя се количеството Афлаток-
син В1 в петната екстракт чрез сравняване на
интензитета на флуоресценцията им с този на
петната стандартен Афлатоксин В1.
5.6. Потвърждаване идентичността на Аф-
латоксин В1
Потвърждава се идентичността на Афлаток-
син В1 в екстракта, както е посочено по-долу.
5.6.1. Обработка със сярна киселина
Напръсква се (спрей) сярна киселина (3.13)
върху хроматограмата, получена в 5.4. Флуо-
ресценцията на петната Афлатоксин В1 при
ултравиолетово облъчване трябва да се превър-
не от синя в жълта.
5.6.2. Двудименсионална хроматография,
свързана с образуване на Афлатоксин В1-полу-
ацетал (Афлатоксин В2А)
Забележка: описаните по-долу операции трябва да се
извършват, като се спазва точно схемата на фигура 1.
Фиг. 1
5.6.2.1. Нанасяне на разтворите
Необходимо е да се маскират две прави ли-
нии върху блюдото (4.8), успоредни на две съсед-
ни страни (на 6 сm от всяка страна), за да се
ограничи миграцията на фронтовете разтвори-
тел. Върху блюдото с капилярни пипети или
микроспринцовки се капват следните разтвори:
—върху точка А—обем от пречистен екст-
ракт от пробата, получен в 5.3, съдържащ око-
ло 2,5 nm Афлатоксин В1;
—върху точки В и С: 25 µl от стандартния
разтвор(3.16).
5.6.2.2. Проявяване
Проявява се хроматограмата в направление
I на тъмно, като се използва проявителят разт-
ворител (3.18.1) (1 сm слой в ненаситена вана),
докато фронтът на разтворителя стигне до ог-
раничителната за разтворителя линия.
Блюдото се изважда от ваната и се оставя да
изсъхне на тъмно при стайна температура в
продължение на 5 min. След това се напръсква
със сярна киселина (3.12) по дължината на иви-
ца 2,5 cm височина, покривайки точки А и В
(показани със защрихованата площ на фиг. 1)
докато потъмнее, като останалата част от блю-
дото се защити със стъкло. Оставя се да взаи-
модейства 10 min на тъмно и се изсушава във
въздушен поток при стайна температура.
След това се проявява хроматограмата в
направление II на тъмно, като се използва про-
явителят разтвор (3.18.1) (1 сm слой в ненасите-
на вана), докато фронтът на разтворителя дос-
тигне ограничителната линия разтворител.
Блюдото се изважда от ваната и се оставя да
изсъхне при стайна температура.
5.6.2.3. Интерпретация на хроматограмите
Хроматограмата се изследва под ултравио-
летова светлина (4.9) и се проверява за следни-
те характеристики: