Държавен вестник, бр. 109, 2002 г., стр. 71

Б Р О Й  109
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
С Т Р .  71
Вода
1000 ml
рН 6,5 до 6,6 (след стерилизация).
4.2. Хранителна среда за извършване на ана-
лиза
Триптон
5 g
Екстракт от дрожди
4 g
Месен екстракт
3 g
Агар-агар
10 до 20 g
Вода
1000 ml
рН 8,0 (след стерилизация).
4.3. Разтвор на натриев хлорид 0,8% (об.т.)
Разтварят се 8 g натриев хлорид във вода и се
разрежда до 1000 ml и се стерилизира.
4.4. Фосфатно-бикарбонатен буфер, рН 8,0
Двукалиев водороден фосфат К2НРО4
16,7 g
Калиев двуводороден фосфат КН2РО4
0,5 g
Натриев водороден карбонат NaHCO3
20 g
Вода до
1000 ml
4.5. Смес на метанолов фосфатно-бикарбо-
натен буфер (4.4)
50/50 об. тегло
4.6. Стандартна субстанция
Спирамицин с известна активност (в IU).
5. Стандартни разтвори
Разтваря се точно претеглено количество
стандартна субстанция (4.6) в сместа (4.5) и се
разтваря със същата смес, за да се получи изхо-
ден разтвор, съдържащ 1000 IU спирамицин на
1 ml. Съхраняван в запушена колба при 4 °С,
този разтвор е стабилен до 5 дни.
От този изходен разтвор се приготвят чрез
последователно разреждане със сместа (4.5)
следните разтвори:
S8 —1 IU/ml
S4 —0,5 IU/ml
S2 —0,25 IU/ml
6. Приготвяне на екстракта и разтворите
за извършване на анализ
6.1. Извличане
Претегля се проба от 20 g при животински
храни и от 1 до 20 g при предварително пригот-
вени смеси. Добавят се 100 ml от сместа (4.5) и
се разтръсква в продължение на 30 min. Цент-
рофугира се или се декантира и плаващият по
повърхността слой се разрежда с разтвора (4.5),
за да се получи очаквано съдържание на спира-
мицин от 1 IU/ml (= U8).
За очаквани нива на спирамицин, по-ниски
от 2,5 mg/kg животинска храна, извличането се
извършва, както следва: претеглят се 20 g про-
ба; добавят се 100 ml от сместа (4.5) и се разт-
ръсква в продължение на 30 min; центрофугира
се в продължение на няколко min, вземат се 50
ml от плаващия на повърхността разтвор и се
изпаряват до около 4 ml при намалено налягане
в ротационен изпарител при температура, не-
превишаваща 40 °С. Остатъкът се разрежда със
сместа (4.5), за да се очаква съдържание на спи-
рамицин от 1 IU/ml (= U8).
6.2. Разтвори за извършване на анализ
От разтвор U8 се приготвят разтвори U4
(очаквано съдържание: 0,5 IU/ml), U2 (очаква-
но съдържание: 0,25 IU/ml) и U1 (очаквано съ-
държание: 0,125 IU/ml) чрез последователно раз-
реждане (1+1) със сместа (4.5).
7. Процедура на извършване на анализа
7.1. Посяване в средата за изпитване
В средата за изпитване (4.2) се посява бакте-
риалната суспензия (3.2) при около 50 °С. Чрез
предварителни опити в петрита със среда за из-
питване (4.2) се определя количеството на бакте-
риалната суспензия, необходимо да се получат
най-големите и най-ясни зони на инхибиране с
различна концентрация на спирамицин.
7.2. Подготовка на петритата
Дифузията през агар-агар се извършва в пет-
рита с четирите концентрации на стандартния
разтвор (S8, S4, S2 и S1) и четирите концентра-
ции на анализирания разтвор (U8, U4, U2 и U1).
Тези четири концентрации на есктракта и стан-
дарта трябва задължително да се поставят във
всяко петри. В тази връзка се избират петрита,
достатъчно големи, за да позволят в средата
агар-агар да се направят поне 8 отвора с диаме-
тър от 10 до 13 mm и не по-малко от 30 mm
между центровете. Тестът трябва да се извър-
ши в петрита, състоящи се от лист стъкло, пок-
рит с алуминиев или пластмасов пръстен, пос-
тавен отгоре, с вътрешен диаметър 200 mm и
височина 20 mm.
В петритата се излива част от средата (4.2),
посята както в 7.1, за да се получи слой, дебел
около 2 mm  (60 ml за петри с диаметър 200 mm).
Оставя се да се изравни, пробиват се дупките и
в тях се обозначават точно премерени обеми от
разтворите за анализиране и стандартните разт-
вори (между 0,10 и 0,15 ml на дупка в зависимост
от диаметъра). Всяка концентрация се полага
поне 4 пъти, така че на всяко определяне да
подлежат на оценка 32 зони на инхибиране.
7.3. Поставяне в инкубатор
Петритата се поставят за 16—18 h при 30 ± 2 °С.
8. Оценяване
Измерва се диаметърът на зоните на инхи-
биране с точност 0,1 mm. Отбелязват се средно-
аритметичните стойности на измерванията за
всяка концентрация върху милиметрова хартия,
показваща логаритъма на концентрациите във
връзка с диаметрите на зоните на инхибиране.
Начертават се линиите на най-добро съответс-
твие на стандартния разтвор и екстракта.
Определя се “най-точно съответстващата”
точка за стандартното най-ниско ниво (SL), като
се използва формулата:
7S1 + 4S2 + S4—S8
SL = –––––––––––   (1)
10
Определя се “най-точно съответстващата”
точка за стандартното най-високо ниво (SH),
като се използва формулата:
7S8 + 4S4 + S2—S1
SH = –––––––––––   (2)
10