Държавен вестник, бр. 48, 2006 г., стр. 138

С Т Р .  138
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  48
—върху колона от мляко най-малко 25 mm ви-
сока и върху обем от мляко 2 ml, към което е доба-
вено 0,05 ml от един от стандартизираните щамо-
ви антигени.
6. Сместа от мляко и антигени се инкубира при
37 °C за не по-малко от 45 min и не повече от 60 min.
Тестът се отчита в рамките на 15 min от изважда-
нето от инкубатора.
7. Реакцията се отчита съгласно следните
критерии:
a) отрицателна реакция: оцветено мляко, без-
цветна сметана;
б) положителна реакция: идентично оцветени
мляко и сметана или безцветно мляко и оцветена
сметана.
Г. Тест с буфериран бруцелозен антиген
Буферираният бруцелозен антиген тест може
да бъде изпълнен по един от следните методи:
a) Ръчен тест
1. Стандартният серум е вторият междунаро-
ден стандартен серум анти-brucella abortus, който
се доставя от Ветеринарната лабораторна агенция,
Addlestone, Weybridge, Англия.
2. Антигенът се приготвя, без да се посочва кле-
тъчната концентрация, но неговата чувствителност
се стандартизира по отношение на втория между-
народен стандартен анти-brucella abortus серум по
такъв начин, че антигенът да произведе положи-
телна реакция при разреждане на серума 1:47,5 и
отрицателна реакция с разреждане 1:55.
3. Антигенът се суспензира в буфериран бруце-
лозен антиген разредител при pH от 3,65 ± 0,5 и
може да бъде извлечен щам чрез употребата на
розов бенгалски оцветител.
4. За приготвяне на антигена се използва
Weybridge щам № 99 или USDA 1119 или всеки щам
с еквивалентна чувствителност.
5. За запазване на щама в лабораторията и за про-
извеждане на антигена се използва култивираща
среда, която не стимулира бактериалното разпадане
(S—R); би следвало да бъде използвана картофена
агар среда или методи на постоянно култивиране.
6. Антигенът се тества срещу осем известни по-
ложителни и отрицателни серуми в замразено и
сушено състояние.
7. Официалният надзор и контрол на стандарт-
ния серум и антиген се изпълнява от официалните
органи, изброени в раздел A, т. 9 от приложението.
8. Антигенът се доставя готов за използване.
9. Буферираният бруцелозен антиген тест се из-
пълнява по следния начин:
a) една капка (0,03 ml) от антиген се поставя до
една капка (0,03 ml) от серума върху бяла пластина;
б) двете капки се смесват с апликаторна бър-
калка, първо в права линия и след това в кръгова
с диаметър 10 до 12 mm;
в) след това пластината се разклаща напред и
назад за 4 min (около 30 пъти на минута);
г) отчитанията се извършват при добра светли-
на; ако няма доказателство за аглутинация, тестът
се счита за отрицателен; всяка степен на аглутина-
ция се счита за положителна, освен ако там има
прекомерно изсушаване около краищата.
б) Автоматизиран метод
Автоматизираният метод трябва да бъде най-
малко толкова чувствителен и прецизен, колкото
е ръчният метод.
Д. Плазмен ринг тест
a) Екстракция на плазмата
Епруветката, съдържаща кръв, чието съсирва-
не е било спряно от добавянето на EDTA, се цен-
трофугира за 3 min при 3000 оборота/мин и след
това се държи при 37 °C за 12 до 24 h.
б) Отчитане
0,2 ml от стабилизираната плазма се поставя в
епруветка с 1 ml необработено мляко. След смес-
ване една капка (0,05 ml) от ABR антиген се доба-
вя и цялото се смесва отново. Използва се стандар-
тен антиген, доставен от орган по раздел A, т. 9 a).
След инкубационен период 45 min при 37 °C се
прави отчитане в рамките на 15 min. Резултатът се
разглежда като положителен, ако цветът на ринга
е станал също като или по-тъмен от този на млеч-
ната колона.
Е. Плазмена аглутинация
Плазмата, извлечена в съответствие с раздел
Д, буква “a”, може да бъде използвана незабавно
след центрофугиране, без да е нужно термично
стабилизиране. 0,05 ml плазма се смесват с 1 ml
антиген за 50 % серумна аглутинация, която съот-
ветства на разреждане 1:20 за серумна аглутина-
ция. Отчитането се извършва след 18 до 24 h инку-
биране при 37 °C. Като положителна се приема
50 % или повече аглутинация.
Ж. Тест за микроаглутинация
1. Разредители се изготвят от 0,85 % физиоло-
гичен разтвор, фенолизиран при 0,5 %.
2. Антигенът се приготвя, както е описано в
раздел A, т. 6, 7 и 8, и се титрира, както е описано
в раздел A, т. 5. При използване на антиген се до-
бавя сафран O при 0,02 % (финално разреждане).
3. Стандартният серум е като по A.1.
4. Стандартният серум се доставя от
Bundesgesundheitsamt, Berlin.
5. Тестът за микроаглутинация се провежда в
корита с клетки с конусовидни дъна с обем 0,250 ml,
както следва:
a) предварително разреждане на серума: 0,050 ml
от всеки серум, който ще се тества, се добавят към
всяка клетка, съдържаща 0,075 ml разредител;
смесите се разклащат за 30 s;
б) постепенно серумно разреждане: приготвят
се най-малко три разреждания за всеки серум, за
целта предварително разредените (1:2,5) 0,025 ml
от всеки серум се взима и прехвърля към клетка,
съдържаща 0,025 ml разредител; по този начин пър-
вото разреждане достига сила 1:5 и следващите
разреждания се изпълняват чрез дублиране;
в) добавяне на антиген: 0,025 ml антиген се
добавя към всяка клетка, съдържаща различните
серумни разреждания, след като бъдат разклаща-
ни за 30 s, коритата се затварят със съответните
им капаци и се държат при 37 °C за 20 до 24 h във
влажна атмосфера;
г) отчитане на резултатите: видът на седимен-
тация на антигена се оценява чрез изследване на
дъното на клетката, отразено във вдлъбнато огле-
дало, поставено върху нея; ако има негативна ре-
акция, антигенът формира седимент във формата
на компактна пъпка с чисти краища и с наситен
червен цвят; ако има положителна реакция от дру-
га страна, се формира равномерно разположено
разпръснато розово покривало. Различните про-
центи на аглутинация се определят чрез сравнение