Държавен вестник, бр. 109, 2002 г., стр. 106

С Т Р .  106
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  109
б) добавя се 0,025 мл от серума за изследване само
в първа ямка от редицата;
в) с микротитрационна пипета се изготвят двукрат-
но нарастващи разреждания на серума—от 1:2 до 1:4096;
г) добавя се по 0,025 мл от работното разреждане на
антигена, съдържащо 4 или 8 ХАЕ/0,025 мл;
д) в няколко ямки на отделна редица се поставят по
2—5 ямки контроли на ЧКК (без вирус и без серум) и
антигенът (без серум);
е) следва внимателно разклащане на плаката за
размесване на инградиентите и инкубиране на 4 °С за
минимум 60 мин или на стайна температура (18—25 °С)
за минимум 30 мин;
ж) добавя се във всяка ямка от редицата, вкл. в
контролите, 1 % еритроцитна суспензия в обем 0,025 мл;
з) следва повторно размесване на инградиентите и
поставяне на 4 °С.
Резултатът се отчита след 30—40 мин или когато
ЧКК в контролните ямки за еритроцити са оформени
на дъното на ямките във вид на точка; при отчитане
плаките се държат в наклонено положение; еритроци-
тите в ямките за контрол на ЧКК и положителните за
специфични антитела серумни разреждания са утаени
под формата на точка и “текат”, а в контролните ямки
за антигена и отрицателните за антитела серумни раз-
реждания образуват нежна пелена на дъното и рамене-
те на ямките и не “текат”.
и) възпиращият титър представлява най-високото
разреждане на изследвания серум, което задържа на-
пълно хемаглутинационната активност на антигена в
4 или 8 ХАЕ; препоръчително е да се направи допълни-
телна проверка, че използваният в теста антиген е в
точно изискваното количество (4, респ. 8 ХАЕ);
й) резултатът от изследването ще бъде валиден при
условие, че титърът на отрицателния контролен серум
не надхвърля 23 при използване антиген с 4 ХАЕ или
22—с 8 ХАЕ, а титърът на положителния контролен се-
рум не се отклонява с повече от едно деление (ямка) в
плюс или минус от предварително известния му титър.
7. Интравенозен патогенен индекс:
а) Тестът ИВПИ се провежда на 10 пилета на шест-
седмична възраст, чувствителни към вируса на инфлу-
енцата по птиците.
б) Пилетата се инокулират интравенозно с вирус-
съдържаща алакто-аруниконова течност от нисък па-
саж, от разреждане 10-1 в доза 0,1 мл. За разредител се
използва стерилен буфериран физиологичен разтвор
(РВS).
в) За контрола се използват 10 пилета от същата
партида, инокулирани по същия начин, и доза от разре-
дителя, без вирус.
г) Опитните и контролните пилета ежедневно се
наблюдават в продължение на 10 дни и резултатите се
регистрират през 24 часа.
д) Резултатите от наблюденията се групират по те-
жест в 4 групи: нормални—без никакви клинични приз-
наци, оценявани с фактор нула; болни—с фактор 1; теж-
ко болни *—с фактор 2, и умрели—с фактор 3.
е) От отчетените резултати се изчислява ИВПИ,
както е показано в таблицата:
Клинични
Дни след инокулацията
Общо резултат
признаци
1
2 3
4 5
6
7
8
9
10
Нормални
10
2
0 0
0
0
0
0
0
0
12 Ч 0 =
0
Болни
0
4
2 0
0
0
0
0
0
0
6 Ч 1
=
6
Тежко болни
0
2
2 2
0
0
0
0
0
0
6 Ч 2
=
12
Умрели
0
2
6 8 10 10 10 10 10 10
76 Ч 3 = 228
общо:
246
Наблюдения
(бр.)
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
100
общо
246
ИВПИ = –––––––––– = ––– = 2,46
наблюдения (бр.)
100
* За тежко болно се счита всяко опитно пиле, което
показва повече от един от следните клинични приз-
наци: респираторни усложнения, депресия, диария,
цианоза на оголените части от кожата и обиците,
оток на главата, нервни признаци.
8. Проучване за плакообразуваща способност:
а) От вируссъдържащата аланто-амнионова течност
се изготвят в РВS 10-кратни нарастващи разреждания—
10-1 до 10-7. Най-добре е да се използват такива разреж-
дания на вируса, които осигуряват оптимален брой
плакти в петрите с възможност за тяхното изброяване.
б) Изготвят се първични монослойни КК от ЕПФ
или подходяща постоянна клетъчна линия (напр. Madin-
Darby bovine kidney) в петриеви панички с размер 5 см
в диаметър.
в) От всяко вирусно разреждане се прибавя в две
петриеви панички по 0,2 мл инокулум. Петритата се
оставят за абсорбция на вируса на стайна температура
за 30 мин.
г) Следва трикратно промиване с РВS на клетъчна-
та повърхност и третираният клетъчен монослой се пок-
рива с 5 мл 1 % w/v разтопен агар, несъдържащ, респ.
съдържащ, 0,01 мгр трипсин за 1 мл среда. Покриваща-
та агарова среда не следва да съдържа никакъв серум.
д) Следва инкубация на петритата с култура на
37 °С за 72 часа, когато образуваните плаки са доста-
тъчно големи по размер и могат да бъдат изброявани
с невъоръжено око. Инкубацията се провежда в среда
с 5 % СО2.
Плаките се виждат най-добре, когато монослоят
бъде оцветен. За целта покриващият слой агарова сре-
да от всяка петра внимателно се отстранява, а остана-
лият прикрепен към дъното клетъчен монослой оцве-
тява с кристал виолет—0,5 % w/v в 25 % V/V етанол.
е) Всички вируси на инфлуенцата по птиците обра-
зуват плаки в посочените КК, които съдържат трипсин.
Плаки в отсъствие на трипсин образуват само вирулент-
ни за птици вирусни изолати на инфлуенцата.
9. Двойнодифузионен агар-гел преципитационен
тест:
Имунодифузионният агар-гел преципитационен
тест е най-предпочитан за доказване присъствие на
нуклеокапсидния (NР) и метричен (М) антиген, кои-
то са общи (групови) за всички субтипове на вируса
на инфлуенцата по птиците. Това се постига чрез из-
ползване като антиген на концентриран вирус или на
суспензия от инфектирани хормоалантоисни мем-
брани (ХАМ).
Вируссъдържащите аланто-амниалови течности се
центрофугират при висока скорост на въртене, при което
вирусните антигени от вътрешността на капсида и на
матрикса се освобождават и допълнително третират с
натриев lauroyl sacrogine. Със същата цел може да бъде
използван и кисел преципитат, т.е. получен чрез трети-
ране на аланто-амнионовите течности с 1 N солна кисе-
лина при крайно рН 3,5—4,0, охлаждане за 1 час но 0 °С
и центрофугиране при ниска скорост—1000 g за 10 мин.
Следва отстраняване на супернатантата, а вируссъ-
държащият преципитат се ресуспендира в минимален
обем на glycine-Sarcosyl буфер (1 % Sodium lauroyl
sacrosinate буфериран до рН 9,0 с 0,5 М glycine). Така
изготвеният препарат съдържа както нуклеокапсидния
(NP), така и матриксния (М) антиген.
Beard (1970) описва изготвянето на обогатен нукле-
окапсиден антиген от ХАМ на инфектирани с вируса на
инфлуенцата КЕ. Хориолактопсните мембрани след
отпрепариране от инфектираните КЕ се хомогенизират
в хаван с пестик или хомогенизатор, след което 3-крат-
но се замразяват и размразяват. Следва нискооборотно
центрофугиране—на 1000 g за 10 мин. За антиген в тес-
та се използва супернатантата, инактивирана с 0,1 %
формалин.
Антигените, изготвени по описаните два метода,
могат успешно да бъдат използвани в рутинния двойно-
дифузионен агар-гел преципитационен тест.