Държавен вестник, бр. 68, 2010 г., стр. 110

СТР.  110	
Д Ъ Р Ж А В Е Н  В Е С Т Н И К 	
БРОЙ  68
29.8.1.3. Неспецифична или слаба амплификация 
и тенденция към образуване на праймерни димери 
трябва да бъдат документирани. 
29.8.2. Секвениране
29.8.2.1.Матрицата за нуклеотидно секвениране 
се характеризира с достатъчна чистота, специфич­
ност, количество и качество.
29.8.2.2. Пречистване на матрицата след амп­
лификация се извършва за отстраняване на dNTP, 
Taq плимераза и амплификационни праймери. 
29.8.2.3. Трябва да бъдат установени критерии 
за приемане на първичните резултати (интензитет 
на пиковете, флуктуации на базовата линия, форма 
на пиковете, точно определяне на константните 
позиции).
29.8.2.4. Съотношението сигнал/шум трябва 
да бъде достатъчно за надеждно определяне на 
нуклеотидите. 
29.8.2.5. Методът за определяне на алелите се 
документира 
29.8.2.6. Трябва да се използват методи, които 
да не допускат позициите, включени в ампли­
фикационните праймери, да се анализират при 
определянето на алелите.
29.8.2.7. Лабораторията документира базата 
данни, използвана при интерпретацията на данните. 
29.8.2.8. Ако определената секвенция е нераз­
граничима, крайният резултат посочва всички 
възможни алелни комбинации.
29.8.3. PCR-SSOP
29.8.3.1.Амплификацията се мониторира чрез 
гел-електрофореза преди извършване на хибри­
дизация. 
29.8.3.2. Всеки анализ включва вътрешна сонда, 
специфична за консервативен регион на ампли­
фицирания продукт. 
29.8.3.3. Всеки анализ включва съответни 
контроли за валидиране на хибридизацията и 
детекцията. 
29.8.3.4. Всяка амплификация и хибридизация 
включва негативна контрола (без ДНК).
29.8.3.5. Автоматичните системи за хибриди­
зация се калибрират най-малко 1 път в годината.
29.8.3.6. При използване на скенери се извърш­
ва второ визуално отчитане за потвърждаване на 
данните. 
29.8.3.7. При автоматизирано отчитане всич­
ки критични елементи, оказващи влияние върху 
функционирането на машината, трябва да бъдат 
мониторирани. Лабораторията документира функ­
ционалната проверка на апаратурата. Почистването 
и калибрирането на флоуцитометър подобните 
инструменти се извършва и документира преди 
използването им. 
30. Определяне на циркулиращи алоантитела
30.1. Лабораторията има документирана полити­
ка за оценяване сенсибилизацията на всеки пациент 
от времето на първоначалното характеризиране.
30.2. Лабораторията има програма за регулярен 
скрининг на серуми от всеки пациент за антитела 
срещу HLA антигени съобразно изискванията за 
трансплантация на органи и медицински стандарт 
„Имунологична подготовка при трансплантация 
на органи, тъкани и клетки“. 
30.3. Лабораторията разполага с документация 
за потенциално сенсибилизиращи събития на всеки 
пациент. Серумите след всяко от тези събития се 
тестуват за антитела срещу HLA антигени и се 
съхраняват за бъдещ кросмач. 
30.4. Определя се и се документира специфич­
ността на HLA антигени, срещу които са насоче­
ни откритите антитела. Необходимо е да бъдат 
разграничени антителата срещу HLA антигени от 
антитела с друга специфичност.
30.5. Използва се класическата комплемент-
зависима лимфоцитотоксична техника и/или друга 
техника с чувствителност, еквивалентна или по-
висока от тази на цитотоксичната.
30.6. За откриване на антитела срещу HLA 
клас II антигени се използва техника, която ги 
разграничава от антитела срещу HLA клас I 
антигени.
30.7. Панелът от HLA антигени включва дос­
татъчен брой донори, за да се обхване най-голям 
брой антигенни специфичности и да се осигури 
съответствие на разпределението им в популацията. 
Броят на индивидите и на антигенните специфич­
ности се документира.
30.8. Комплемент зависим лимфоцитотокси­
чен тест:
30.8.1. Във всяка плака се включва HLA спе­
цифична положителна контрола за активността 
на комплемента и отрицателна контрола за жиз­
неспособността на тестуваните клетки.
30.8.2. ИгГ и ИгM положителни контроли се 
включват, ако серумите се изследват след трети­
ране с дитиотреитол (ДТТ).
30.9. Микросферов тест:
30.9.1. Лабораторията има утвърдена процедура 
за контролиране на неспецифичното свързване на 
антитела към таргетните микросфери.
30.9.2. Всяко изследване задължително включва 
отрицателна контрола – серум от неалоимунизиран 
човешки донор(и). 
30.9.3. Всяко изследване включва положителна 
контрола – серуми от алоимунизирани индивиди, 
за които е документирано, че реагират с HLA 
антигени. Антителата са от подходящия за из­
следването изотип. 
30.9.4. Лабораторията трябва да има изработени 
критерии за разграничаване на позитивните от 
негативните реакции.
30.10. Имуноензимен тест.
30.10.1. Всяко изследване на алоантитела чрез 
ИЕМ включва отрицателна и положителна серумна 
контрола както при микросферовия анализ.
30.10.2. Контрола без HLA антиген се включва 
в тест-системата.
30.10.3. Лабораторията документира свой собст­
вен праг на сигнификантни нива на антитялово 
свързване.
31. Определяне на тъканна съвместимост чрез 
кросмач реакция.
31.1. Кросмач реакцията се извършва про­
спективно.
31.2. Използват се техники с еквивалентна 
чувствителност на скриниращия алоантителата 
тест. Могат да бъдат използвани тестове с доказана 
повишена чувствителност в сравнение с основния