Държавен вестник, бр. 27, 2007 г., стр. 19

Б Р О Й  27
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
С Т Р .  19
3.2.2. Обработете частите по една от следните
процедури: или
(a) покрийте частите с достатъчен обем (приб-
лизително 40 ml) екстракционен буфер (Допълне-
ние 3) и разклатете на ротационна клатачка (50 до
100 rpm) за 4 h при температура, по-ниска от 24 °C,
или за 16 до 24 h в хладилник, или
(б) обработете незабавно; като ги стриете в
здрава торбичка за мацерация (напр. Stomacher или
Bioreba) с подходящ обем екстракционен буфер
(Допълнение 3), използвайки гумено чукче или
подходящ апарат за счукване (напр. Homex); ако
това не е възможно, съхранявайте частите от стъб-
лата охладени не по-дълго от 72 h или не по-дълго
от 24 h при стайна температура.
3.2.3. Прелейте супернатантата след утаяване
от 15 min.
3.2.4. По-нататъшно избистряне на екстракта
или концентрата на бактериалната фракция обик-
новено не се изискват, но могат да бъдат постигна-
ти чрез филтрация и/или центрофугиране, както е
описано в раздел 3.1.4 до 3.1.6.
3.2.5. Разделете чистия или концентриран екс-
тракт от пробата на 2 равни части. Поддържайте
едната половина при 4 до 10 °C по време на тества-
нето и съхранявайте другата половина с 10 до 25 %
(v/v) стерилен глицерол при—16 до—24 °C (седми-
ци) или при—68 до—86 °C (месеци) в случай, че се
налага по-нататъшно тестване.
4. Имунофлуоресцентен тест
Принцип
Използването на имунофлуоресцентен тест като
основен скринингов тест се препоръчва поради до-
казаната му яснота да постига изискваните нива.
Когато се използва имунофлуоресцентен тест
като основен скринингов тест и резултатите от иму-
нофлуоресценцията са положителни, то PCR или
FISH тест трябва да бъдат извършени като втори
скринингов тест. Когато имунофлуоресцентен тест
се използва като втори скринингов тест и резулта-
тите от имунофлуоресценцията са положителни,
за да се завършат анализите, се изисква по-ната-
тъшно тестване съгласно диаграмата.
Важно:
Винаги използвайте поликлонални антитела,
когато се използва имунофлуоресцентен тест като
основен скринингов тест. В случай на положителни
резултати от имунофлуоресценцията с поликлонал-
ни антитела по-нататъшен скрининг на пробата с
моноклонални антитела може да предостави повече
специфичност, но тестът е по-слабо чувствителен.
Използвайте антителата за референтен щам на
C. m. subsp. sepedonicus. Препоръчително е титъ-
рът да се определя за всяка нова серия антитела.
Титърът се определя като най-високото разрежда-
не, чиято оптимална реакция настъпва, когато при
тестване на суспензия, съдържаща 105  до 106 клет-
ки на ml от хомоложен щам на C. m. subsp.
sepedonicus, и използвайки флуоресцентен изотио-
цианатен (FITC) конюгат, се осъществи свързва-
не съгласно препоръките на производителя.
Суровите поликлонални или моноклонални ан-
титела трябва да имат титър от поне 1:2000. По
време на тестването антителата трябва да бъдат
използвани при работни дози (WD), близки до/или
равни на титъра.
Използвайте валидирани антитела (виж интер-
нет страницата http://forum.europa.eu.int/Public/irc/
sanco/Home/main.
Тестът трябва да се провежда на прясно при-
готвени екстракти от пробата. Ако е необходимо,
може да бъде успешно проведен и тест на екстрак-
ти, съхранявани при—68 до—86 °C в глицерол. Гли-
церолът може да бъде премахнат от пробата чрез
добавяне на 1 ml буфер за разтваряне на утайката
(Допълнение 4), повторно центрофугиране за
15 min при 7000 g и ресуспензиране в еднакъв обем
от буфер за разтваряне на утайката. Това често не
е необходимо, особено ако пробите на стъклата са
добре фиксирани към тях след опламеняването
(виж  2.2).
Изгответе стъкла с положителни контроли от
хомоложен щам или друг референтен щам на C. m.
subsp. sepedonicus, суспендирани в картофен из-
влек, както е описано в Допълнение 2, и по избор
в буфер.
Естествено заразената тъкан (поддържана чрез
лиофилизация или замразяване при—16 до—24 °C)
трябва да бъде използвана, където е възможно като
подобна контрола на същото стъкло.
Като отрицателни контроли използвайте раз-
реждания от извлек на пробата, които са показали
отрицателни резултати при тестването преди това.
Използвайте предметни стъкла с много гнезда,
препоръчително е с 10 прозорчета от поне 6 mm в
диаметър.
Тествайте контролния материал по еднакъв
начин, както пробата(ите).
4.1. Пригответе стъклата за тестване по една
от следните процедури:
а) За утайки с относително малко количество
от скорбяла:
Пипетирайте един стандартен обем (15 µl е под-
ходящ за прозорче с диаметър 6 mm, увеличете
обема за по-големи прозорчета) от разтвор 1/100
от ресуспендираната картофена утайка върху пър-
вото прозорче. След това пипетирайте подобен
обем от неразтворената утайка (1/1) върху остана-
лите прозорчета на редицата. Вторият ред може да
се използва за дубликат или за втора проба, така
както е представено на фиг. 1.
б) За други утайки:
Пригответе децимални разтвори (1/10 и 1/100)
от ресуспендираната утайка в буфер за утайки.
Пипетирайте един измерен стандартен обем (15 µl
е подходящ за прозорче с диаметър 6 mm, увеличе-
те обема за по-големи прозорчета) от ресуспенди-
раната утайка и всяко разреждане на един ред от
прозорчета. Вторият ред може да се използва за
дубликат или за втора проба, така както е предста-
вено на фиг. 2.
4.2. Изсушете капките на стайна температура
или чрез затопляне при температура от 40 до 45 °C.
Фиксирайте бактериалните клетки на стъклото
чрез загряване (15 min при 60 °C), опламеняване
или с 95 % етанол, или съгласно специфичните
инструкции на доставчиците на антителата.
Ако е необходимо, фиксираните стъкла могат
да бъдат съхранявани замразени в суха кутия за
кратко време (максимум до 3 месеца) преди по-
нататъшно тестване.
4.3. Имунофлуоресцентна процедура: