Държавен вестник, бр. 28, 2007 г., стр. 44

С Т Р .  44
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  28
6. PCR тестове
Принципи
Когато PCR тест се използва като основен скри-
нингов тест и резултатите от него са положител-
ни, трябва да се направи изолация или IF тест като
втори задължителен скринингов тест. Когато PCR
тестът се използва като втори скринингов тест и
резултатите от него са положителни, трябва да се
направи допълнително тестване в съответствие със
схемата, за да завърши диагностицирането.
Пълното използване на този метод като ос-
новен скринингов тест се препоръчва само кога-
то са натрупани необходимите експертни знания
и умения.
Забележка. Предварителното изпитване с по-
мощта на този метод трябва да позволява възпро-
изводимо установяване на 103 до 104 клетки на R.
solanacearum на ml в екстракти от проби, които са
дали отрицателни резултати при предишно изпит-
ване. За да се постигнат максимални нива на чув-
ствителност и конкретност във всички лаборато-
рии, може да се наложи експериментиране с цел
оптимизиране на изпитването.
Използват се валидирани PCR реагенти и про-
токоли (виж Допълнение 6). По-добре е да се избе-
ре метод с вътрешна контрола.
Използват се подходящи предпазни мерки, за
да се избегне заразяване на пробите с ДНК. За да
се минимизира възможността за заразяване с ДНК,
PCR тестът трябва да се провежда от опитни тех-
нически лица в специализирани лаборатории по
молекулярна биология.
Отрицателните контроли (за екстракция на
ДНК и за PCR процедури) винаги трябва да се
обработват като окончателни проби в процеду-
рата, за да стане ясно дали е настъпило пренася-
не на ДНК.
В PCR теста трябва да се включат следните
контроли:
—Екстракт от проба, която е дала отрицате-
лен резултат за R. solanacearum при предишно из-
питване.
—Буферни контроли, използвани за екстрак-
ция на бактерията и ДНК от пробата.
—Микс за PCR реакция.
Включват се задължително следните положи-
телни контроли:
—Количества от разтворени утайки, към кои-
то е добавена R. solanacearum (изготвяне виж в До-
пълнение 3Б).
—Суспензия от 106 клетки на ml R. solanacearum
във вода от вирулентен щам (например NCPPB
4156 = PD 2762 = CFBP 3857; виж Допълнение 3Б).
—При възможност се използва също ДНК, екс-
трахирана от положителни контролни проби в PCR
теста.
За да се избегне потенциално заразяване, поло-
жителните контроли се приготвят отделно от про-
бите за тестване.
Екстрактите от проби трябва по възможност да
не са замърсени с почва. Затова в някои случаи се
препоръчва да се приготвят екстракти от измити
картофи, когато ще се използват PCR протоколи.
Стандартизираните положителни и отрицател-
ни контролни материали, които могат да се изпол-
зват в този тест, са изброени в Допълнение 3.
6.1. Методи за пречистване на ДНК.
Използват се описаните по-горе положителни и
отрицателни контролни проби (виж Допълнение 3).
Контролите се изпитват по същия начин както
пробата/пробите.
Съществуват голям брой методи за пречиства-
не на ДНК от сложни пробни субстрати, като се
отстраняват инхибиторите на PCR и други ензим-
ни реакции и се концентрира ДНК в екстракта от
пробата. Следващият метод е оптимизиран за из-
ползване на валидираните PCR методи, дадени в
Допълнение 6.
(а) Метод на Pastrik (2000)
1) Отмерва се с пипета 220 µl буфер за лизиране
(100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA
[pH 8,0]) в епендорфова епруветка от 1,5 ml.
2) Прибавя се 100 µl екстракт от пробата и се
поставя в подгряващ блок или водна баня при 95 °С
за 10 минути.
3) Епруветката се поставя в лед за 5 минути.
4) Прибавя се 80 µl Lysozyme стоков разтвор
(50 mg Lysozyme на ml в 10 mM Tris HCl, pH 8,0) и
се инкубира при 37 °С за 30 минути.
5) Прибавя се 220 µl Easy DNA® разтвор A
(Invitrogen), разбърква се добре на Vortex и се ин-
кубира при 65 °С за 30 минути.
6) Прибавя се 100 µl Easy DNA® разтвор В
(Invitrogen), разбърква се силно, докато преципи-
татът започне да се движи свободно в епруветката
и пробата става еднородна.
7) Прибавя се 500 µl хлороформ и се разбърква
до намаляване на вискозитета и сместа стане хо-
могенна.
8) Центрофугира се при 15 000 g за 20 минути
при 4 °С за отделяне на фазите и създаване на фа-
зова граница.
9) Горната фаза се прехвърля в чиста епендор-
фова епруветка.
10) Прибавя се 1 ml 100 % етанол (-20 °С), раз-
бърква се бързо и се инкубира в лед за 10 минути.
11) Центрофугира се при 15 000 g за 20 минути
при 4 °С и се отстранява етанолът от утайката.
12) Прибавя се 500 µl 80 % етанол (-20 °С) и се
разбърква чрез обръщане на епруветката.
13) Центрофугира се при 15 000 g за 10 минути
при 4 °С, оставя се утайката и се отстранява ета-
нолът.
14) Утайката се оставя да изсъхне на въздух
или в DNA speed vac.
15) Разтваря се отново утайката в 100 µl сте-
рилна ултрачиста вода и се оставя на стайна тем-
пература най-малко за 20 минути.
16) Съхранява се при -20 °С, докато потрябва
за PCR.
17) Утаява се белият преципитат чрез центро-
фугиране и се използват 5 µl от надутайката, съ-
държаща ДНК за PCR.
б) Други методи
Могат да се използват и други методи за екс-
тракция на ДНК, например Qiagen DNeasy Plant
Kit, при условие че са доказали, че са еднакво ефек-
тивни при пречистване на ДНК от контролни про-
би, съдържащи 103 до 104 клетки на патогена за ml.
6.2. PCR
6.2.1. Приготвят се тестови и контролни мат-
рици за PCR в съответствие с валидираните прото-