Държавен вестник, бр. 109, 2002 г., стр. 33

Б Р О Й  109
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
С Т Р .  33
Претеглят се 2 g от пробата с точност до mg
и се пренасят в мерителна колба от 500 ml.
Добавят се 450 ml разтвор на пепсин хидрохло-
рид (3.4), предварително нагрят до 40°C, и се
разклаща, за да се предотврати образуването на
агломерати. Проверява се рН на суспенсията да
е по-малко от 1,7. Колбата се поставя във водна
баня или в термостат (4.1) и се оставя там за
48 h. Разклаща се след 8, 24 и 32 h. След 48 h се
прибавят 15 ml солна киселина (3.1), охлажда се
до 20°C, обемът се допълва с вода и се филтрува.
5.2. Хидролизиране
250 ml от филтрата се пренасят в колбата на
дестилационния апарат (4.2). Добавят се реа-
гентите, необходими за хидролизата, указани
във второто изречение на т. 5.1 от метода за
определяне на суров протеин. Хомогенизира се
и се довежда до кипене. Ако се образува пяна, се
добавят няколко капки емулсия за гасене на
пяна (3.5). Кипенето продължава енергично
докато водата се изпари почти напълно. Нама-
лява се нагряването и последните следи от вода
внимателно се отстраняват.
Когато разтворът се избистри и обезцвети
(или цветът стане светлозелен, ако е използван
катализатор, съдържащ мед), кипенето продъл-
жава още 1 h. Оставя се да изстине.
5.3. Дестилация и титруване.
Процедира се, както е указано в т. 5.2 и 5.3 от
метода за определяне на суров протеин.
5.4. Празна проба
Празната проба се прави, като се прилага
същата процедура с пропускане на пробата,
която трябва да бъде анализирана.
6. Пресмятане на резултатите
Обемът на сярната киселина, използвана при
празната проба, се изважда от обема, използ-
ван при изследваната проба. 1 ml 0,1 N сярна
киселина съответства на 1,4 mg азот.
Количеството на азота се умножава по кое-
фициент 6,25. Резултатът се изразява като про-
цент от пробата.
Повторяемост
Разликата между резултатите от две пара-
лелни определяния, проведени с една и съща
проба, не трябва да надвишават:
• 0,4 като абсолютна стойност, при съдър-
жание по-малко от 20%;
• 2,0% като относителна стойност, при съ-
държание не по-малко от 20% и не повече от
40%;
• 0,8 като абсолютна стойност, при съдър-
жание повече от 40%.
7. Наблюдения
7.1. Стойностите, получени чрез този метод
нямат непосредствена пряка връзка със смила-
емостта in vivo.
7.2. Продукти, съдържащи повече от 10%
масла или мазнини, трябва първо да бъдат обез-
маслени чрез екстрахиране с петролев етер (точ-
ка на кипене 40—60°C).
ХХIV. Определяне активността на пепсин
1. Цел и обхват
Този метод дава възможност да се определи
активността на пепсина, който се използва при
определяне на суровия протеин чрез хидроли-
зиране с пепсин и солна киселина.
2. Принцип
Хемоглобинът се обработва при определе-
ни условия с пепсин в среда, съдържаща солна
киселина. Нехидролизираната фракция на про-
теина се преципитира с трихлороцетна кисели-
на. Към филтрата се прибавят натриева основа
и реактив на Folin-Ciocalteu. Оптичната плът-
ност на разтвора се измерва при 750 nm и ко-
личеството на тирозина се определя по калиб-
ровъчна крива.
Определение—за единица пепсин се приема
това количество от този ензим, което в услови-
ята на метода освобождава за 1 min такова ко-
личество хидроксиарилни групи, които, оцве-
тени с реактива на Folin-Ciocalteu, имат оптич-
на плътност, съответстваща на оптичната плът-
ност на 1 µmol тирозин, оцветен по същия на-
чин.
3. Реактиви:
3.1. 0,2 N солна киселина.
3.2. 0,06 N солна киселина.
3.3. 0,025 N солна киселина.
3.4. 5% разтвор (т/о) на трихлороцетна кисе-
лина.
3.5. 0,5 N разтвор на натриева основа.
3.6. Реактив на Folin-Ciocalteu. В облодънна
колба от 2 l със стандартно шлифовано гърло се
поставят 100 g натриев волфрамат (Na2WO4.2H2O),
25 g натриев молибдат (Na2MoO4.2H2O) и 700 ml
вода. Прибавят се 50 ml фосфорна киселина (плът-
ност 1.71) и 100 ml концентрирана солна кисели-
на (плътност 1.19), колбата се свързва с обратен
хладник, нагрява се до завиране и в продължение
на 10 h се поддържа слабо кипене. Оставя се да
изстине, демонтира се хладникът и се добавят
175 g литиев сулфат (Li2SO4.2H2O), 50 ml вода и 1
ml бром. Вари се 15 min, за да се отстрани излишъ-
кът от бром.
Разтворът се оставя да изстине, пренася се в
мерителна колба от 1 l, обемът се допълва с вода,
разбърква се и се филтрува. Не трябва да остава
зеленикаво оцветяване. Преди употреба реакти-
вът се разрежда с вода в съотношение 1:2.
3.7. Разтвор на хемоглобин. Претегля се ко-
личество хемоглобин (около 2 g белтъчен суб-
страт, определен по Anson), съответстващо на
354 mg азот (1) и се пренася в колба от 200 ml със
стандартно шлифово гърло. Прибавят се някол-
ко ml солна киселина (3.2), колбата се свързва
с вакуумпомпа и се разклаща, докато хемогло-
бинът се разтвори напълно. Вакуумът се осво-
бождава и обемът се допълва до 100 ml със сол-
на киселина при разклащане. Приготвя се не-
посредствено преди употреба.
3.8. Стандартен разтвор на тирозин—181,2
mg тирозин се разтварят в солна киселина (3.1)
и обемът се допълва до 1 l със същата киселина