Държавен вестник, бр. 55, 2010 г., стр. 68

СТР.  68	
Д Ъ Р Ж А В Е Н  В Е С Т Н И К 	
БРОЙ  55
4.3.4.24. Апаратура за секвениране.
4.4. Аналитични принципи за осъществяване 
професионалната дейност на специализираните 
вирусологични дейности:
Необходимо е да се използват аналитични­
те принципи за осъществяване дейността на 
вирусологичните лаборатории, възприети от 
Националния комитет за клинични лабораторни 
стандарти (NCCLS, USA), Българското научно 
дружество по вирусология и подзаконовите нор­
мативни актове.
4.4.1. Изследвания за изолиране и инденти­
фикация на вируса причинител:
4.4.1.1. Вирусологични изследвания, свързани 
със заразяване на кокоши ембриони. Материали 
от болни (носоглътъчни смивове, трупни мате­
риали) се инокулират на кокоши ембриони с цел 
изолация на вируса причинител.
4.4.1.2. Вирусологични изследвания, свързани 
със заразяване на клетъчни култури. Материали от 
болни (носоглътъчни смивове, трупни материали, 
везикуларна течност, ликвор, фекални проби и др.) 
се инокулират на биологичен модел – клетъчни 
култури, с цел изолация на вируса причинител.
4.4.1.3. Вирусологични изследвания, свързани 
със заразяване на опитни животни.
Материали от болни (кръвни проби, трупни 
материали и др.) се инокулират на биологичен 
модел – опитни животни, с цел изолация на 
вируса причинител.
4.4.2. Изследвания за откриване на вирусни 
антигени и/или антитела срещу тях:
4.4.2.1. Реакция имунофлуоресценция (РИФ):
Конюгираните с флуоресцеин-изотиоцианат 
специфични антисеруми се свързват с хомо­
ложните антигени в материали от болни, което 
прави виден комплексът антиген-антитяло с 
флуоресцентен микроскоп.
4.4.2.2. Реакция за задръжка на хемаглути­
нацията (РЗХА):
Основава се на свойството на вирусни анти­
хемаглутинини да възпрепятстват специфичната 
хемаглутинация, причинена от изследваните 
вируси.
4.4.2.3. Реакция неутрализация (РН):
Основава се на свойството на специфичните 
вируснеутрализиращи антитела от изследваните 
серуми да неутрализират цитопатичния ефект 
на клетъчната култура или да изменят pH на 
културалната среда.
4.4.2.4. Реакция свързване на комплемента 
(РСК):
Основава се на свойството на антителата от 
серума да се свързват специфично с вирусните 
антигени в присъствие на комплемента и да въз­
препятства хемолизата в хемолитичната система.
4.4.2.5. Имуноензимен метод (ELISA; EIA):
Методът има различни модификации и вари­
анти. Основава се на специфичното свързване на 
търсените антигени и антитела на твърда фаза с 
последваща специфична имуноензимна реакция 
с конюгирани с ензим антитела или антигени. 
Цветната реакция след прибавянето на субстрата 
се отчита спектрофотометрично. Конкурентният 
вариант на метода се базира на инхибиция на 
имуноензимната реакция вследствие на конку­
ренцията на търсените и конюгираните с ензим 
антитела за едно и също количество антиген.
Сходни методи са: микрочастици EIA-MEIA, 
имунохемилуминесценция – СhLIA, ензимно­
свързана флуоресценция – ELFA, електрохеми­
луминесценция – ECLIA и др.
4.4.2.6. Електрофоретично разделяне на ви­
русни антигени – идентифициране на вирусните 
антигени според молекулните им тегла на денату­
риращи полиакриламидни гелове, визуализирани 
с комаси или сребърен нитрат.
4.4.2.7. Имуноблот – доказване на вирусни 
специфични антитела срещу отделни вирусни 
антигени. Принципът на метода е на основата 
на взаимодейвие на електрофоретично разделен 
вирус – специфични протеини, имобилизирани 
върху твърди носители с нерадиоактивно белязани 
вирусни поликлонални/моноклонални антитела. 
Специфичните антиген-антитяло комплекси се 
визуализират с ензимно-субстратна реакция.
4.4.3. Изследвания за идентифициране и доказ­
ване на генетични вирусни последователности:
4.4.3.1. Типизиране на вируси въз основа на 
големината на вирусните геноми. Електрофоре­
тично разделяне на нуклеотидни последовател­
ности на полиакриламидни или агарозни гелове, 
визуализирани с етидиев бромид. Вирусните 
геноми се идентифицират въз основа на дъл­
жината на нуклеотидните последователности на 
вирусния геном в килобази.
4.4.3.2. Фрагментно-рестриктазен анализ за 
типизиране на вируси: методът типизира вирусни 
щамове въз основа на консервативни последова­
телности от вирусния геном, които се разпознават 
от специфични екзонуклеазни ензими.
4.4.3.3. Полимеразна верижна реакция (PCR): 
идентифицира и доказва присъствието на ви­
русни геноми в биологични течности, тъкани 
и клетъчни популации чрез амплифициране на 
нуклеотидни последователности от вирусния 
геном с помощта на ензими и специфични син­
тетични олигонуклеотиди.
Когато вирусният обект е PHK съдържащ 
вирус, предварително се прилага ензимна стан­
дартизирана обратно транскриптазна реакция 
in vitro (RT-PCR) с последваща амплификация 
на DNA провирусния геном за определяне на 
наличие (качествено) или концентрация (ко­
личествено) на вирусни геноми в биологични 
течности/тъкани. Прилага за определяне на 
вирусното размножение – количествено или 
качествено (наличие, липса), както и за про­
следяване и оценка на ефекта при прилагане 
на антивирусни терапии.
4.4.3.4. Секвенционен анализ:
Разчита нуклеотидните бази, кодиращи ви­
русния геном чрез електрофоретично разделяне. 
Нуклеотидите са белязани с радиоизотопни или 
флуоресцентни маркери. Методът дава възмож­
ност за пълно идентифициране на нуклеотидните 
последователности на вирусния геном и опре­
деляне на единични точкови мутации. Намира