Държавен вестник, бр. 27, 2007 г., стр. 25

Б Р О Й  27
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
С Т Р .  25
ниски популации на C. sepedonicum, отколкото по-
старите растения и оттам следва необходимостта
да се използват растения в третата фаза на раз-
листване или точно преди нея. Увяхването може
също да се предизвика и от популации на други
бактерии или гъби, намиращи се в концентрира-
ния екстракт (мацерат) от картофените клубени.
В тях са включени Ralstonia solanacearum, Erwinia
carotovora subsp. carotovora and E. carotovora subsp.
atroseptica, Erwinia chrysanthemi, Phoma exigua var.
foveata, както и големи популации на сапрофитни
бактерии. В частност Erwinia chrysanthemi може
да предизвика симптоми по листата и увяхване,
които са много сходни с тези на C. m. sepedonicus.
Единствената разлика е почерняването на стъб-
лата в случай на инфекции с Erwinia chrysanthemi.
Другите увяхвания могат да бъдат разграничени
от увяхването, причинено от C. sepedonicum, тъй
като при него цели листа или цели растения бър-
зо увяхват. Също така може да се направи тест—
оцветяване по Грам: като по този начин ще се
разграничи C. m. subsp. sepedonicus от Erwinia spp.
7.9. Веднага щом започнат да се наблюдават
симптоми при патладжаните, трябва да се направи
нова изолация, като се използват участъци от тъ-
кан на увехнали листа или тъкани от стъбла на рас-
тения (виж 3.1.3 за мацерация). Повърхността на
листата и стъблата на патладжаните се дезинфек-
цира със 70 % етанол. Направете имунофлуоресцен-
тен тест или PCR на патладжанен извлек и изоли-
райте на подходяща (селективна) среда (виж раз-
дел 8). Може също да се приготви и Грам оцветява-
не (Допълнение 9). Идентифицирайте пречистени
култури от предполагаем C. m. subsp. sepedonicus и
потвърдете патогенността (виж раздел 9 и 10).
7.10. При определени обстоятелства, особено
там където условията на растеж не са оптимални,
е възможно C. sepedonicum да присъства като ла-
тентна инфекция в патладжаните дори след инку-
бационен период от 4 седмици. Ако не се наблюда-
ват симптоми след 4 седмици, извършете IF/PCR
на смесена проба на 1 cm части от стъбла от всяко
тестово растение, взети от участъка над инокула-
цията. Ако тестът е положителен, трябва да се
извърши наново изолация върху подходяща (селек-
тивна) среда, следвайки процедурата от раздел 8.
Идентифицирайте пречистени култури от предпо-
лагаем C. m. subsp. sepedonicus и потвърдете пато-
генността (виж раздел 9 и 10).
Тълкуване на резултатите от биологичния тест
* Валидни резултати от биологичния тест се
получават, когато растенията от положителните
контроли показват типични симптоми, бактерии-
те могат да бъдат повторно изолирани от тези
растения и не са открити симптоми по отрицател-
ните контроли.
* Биологичният тест е отрицателен, ако тесто-
вите растения не са заразени с C. m. subsp.
sepedonicus и при условие че C. m. subsp. sepedonicus
се открива в положителните контроли.
* Биологичният тест е положителен, ако тесто-
вите растения са заразени с C. m. subsp.sepedonicus.
8. Изолиране на  C. m. subsp. sepedonicus
Забележка.
Диагностицирането може да се потвърди, само
ако C. m. subsp. sepedonicus бъде изолирана, в пос-
ледствие идентифицирана (виж раздел 9) и потвър-
дена с патогенен тест (виж раздел 10). Независимо
че C. m. subsp. sepedonicus е труден за изолиране
вредител, той може да се изолира от тъкани с харак-
терни симптоми.
Тъй като C. m. subsp. sepedonicus расте по-бав-
но, то той лесно може да бъде потиснат от други
бързорастящи сапрофитни бактерии и това пра-
ви директното му изолиране от клубенова проба
или утайка от стъблена тъкан (мацерат) (раздел
3.1.6 или 3.2.5.) затруднено. Но използването на
селективна хранителна среда и подходящо раз-
реждане на повторно разредена утайка (мацерат)
от конусите или от стъблата на картофите прави
директното изолиране на C. m. subsp. sepedonicus
възможно да се осъществи. Изолирането трябва
да се прави от всички картофени клубени или
части от стъбла със симптоми и от растенията
на патладжана, при които не се наблюдават сим-
птоми, но IF/PCR тестът от смесената проба е
бил положителен (виж раздел 7.10). Когато е не-
обходимо, мацерацията на стъблата на патладж-
аните може да бъде извършена, както е описано
в раздел 3.1.3.
Като положителни контроли пригответе деци-
мални разреждания на суспензия от 106 клетки на
ml от C. m. subsp. sepedonicus (напр. NCPPB 4053
или PD 406). За да се избегне каквато и да е веро-
ятност от заразяване, пригответе положителните
контроли напълно отделно от пробите, които ще
се тестват.
За всяка новоприготвена серия от селективна-
та среда, трябва да се извърши тестване за нейната
пригодност за растеж на патогена преди използва-
нето и за рутинните проби.
Тествайте контролния материал по идентичен
начин като пробата(-ите).
8.1. Селективна посявка
8.1.1. Вземете 100 µl от пробата, получена след
повторно разтваряне на картофената утайка (ма-
церат) или сок от патладжан и направете 10-крат-
ни (децимални) разреждания в буфер за утайка
(Допълнение 3).
8.1.2. Изолирането от неразредена картофена
утайка обикновено се проваля поради трудния рас-
теж на Cms и конкуренцията му със сапрофитите.
Тъй като бактерията обикновено присъства в го-
леми популации по заразените тъкани, плътност-
та на сапрофитите може да бъде разреждана, дока-
то патогенът остане. Поради това се препоръчва
да се разпредели по 100 µl от всяка проба, от 1/100
до 1/10 000 разреждания, върху MTNA среда или
NCP-88 среда (Допълнение 5) (ако се използват
петриеви блюда с диаметър 90 mm, излейте необ-
ходимия обем среда, съответстващ на размера на
блюдата), използвайки шпатула и подходяща ла-
бораторна техника за разстилане.
Забележка.
Друга алтернативна стратегия е да се направи
посявка с начално количество от 100 µl картофен
извлек върху едно петриево блюдо с помощта на
шпатула за разстилане и след това да се премине
към второто петри, разстилайки останалия по ин-
струмента за разстилане извлек, и най-накрая да се
приложи върху трето петри, като по този начин про-
извеждате ефект на разреждане върху петриевите
блюда чрез инструмента за разстилане.