Държавен вестник, бр. 27, 2007 г., стр. 24

С Т Р .  24
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  27
Тълкуване на резултата от PCR теста:
PCR тестът е отрицателен, ако специфичният
за C. m. subsp. sepedonicus PCR амплификат с очак-
вания размер не се намира в съответната проба, но
се намира във всички положителни контролни про-
би (в случай на многостепенна PCR със специфич-
ни за растението вътрешни контролни праймери:
втори PCR-продукт с очаквания размер трябва да
бъде намножен от съответната проба).
PCR тестът е положителен, ако специфичният
за C. m. subsp. sepedonicus PCR амплификат с очак-
вания размер и рестрикционен модел се открива,
при условие че не се амплифицира от никоя отри-
цателна контролна проба. Достоверно потвърж-
дение на положителен резултат може също да се
получи чрез повтаряне на теста с втора серия от
PCR праймери (раздел 9.3).
Забележка.
Може де се предполага инхибиране на PCR, ако
очакваното намножаване е получено от проба с по-
ложителна контрола, съдържаща C. m. subsp.
sepedonicus във вода, но отрицателни резултати са
били получени от положителни контроли с C. m.
subsp. sepedonicus в картофен извлек. В многосте-
пенни PCR протоколи с вътрешни PCR контроли
има индикации за инхибиране тогава, когато не е
получен нито един от двата амплификата.
Може да се предполага заразяване, ако очаква-
ният амплификат се получава от една или повече
отрицателни контроли.
7. Биологичен тест
Забележка.
Предварително тестване с този метод трябва да
позволи възпроизводимо откриване от 103 до 104 клет-
ки от C. m. subsp. sepedonicus на ml прибавен към ек-
стракт от проба, която преди това е дала отрицателен
резултат (за приготвянето виж Допълнение 2).
Най-висока чувствителност на установяване
може да се очаква, когато се използва прясно при-
готвен екстракт и оптимални условия за растеж.
Въпреки това методът може успешно да се прило-
жи и за екстракти, които са били съхранявани с
глицерин при—68 до—86 °C.
Някои сортове патладжан осигуряват отлична
селективна обогатяваща среда за растеж на C. m.
subsp. sepedonicus дори при отсъствие на симпто-
ми, а също така са и отличен гостоприемник при
тестове за потвърждаване.
Условията за растеж трябва да са оптимални,
за да се намали рискът от фалшиви отрицателни
резултати от теста.
За подробности за отглеждането виж допъл-
нение 8.
7.1. Разпределете цялата оставаща част за тест-
ване от ресуспендираната утайка от раздел 3.1.6
или 3.2.5 между патладжаните по един от методи-
те, дадени по-долу (7.3 или 7.4). Използвайте само
растения в стадий втори-трети до напълно развит
трети същински лист. За да се гарантира пълно
оползотворяване на ресуспендираната утайка, как-
то и ефективна инокулация /инжектиране, за под-
чертаните по-долу процедури са необходими 15 до
25 растения от патладжан за проба.
7.2. Не поливайте патладжаните един или два
дни преди инокулацията, за да намалите тургурно-
то налягане.
7.3. Инокулация чрез срязване
7.3.1. Придържайки растението между два пръс-
та, пипетирайте една капка (приблизително 5 до 10
µl) от суспендираната утайка върху стъблото между
котиледоните (семеделни листа) и първия лист.
7.3.2. Използвайки стерилен скалпел, направе-
те диагонален разрез около 1,0 cm и дълбок приб-
лизително до 2/3 от дебелината на стъблото, за-
почвайки разреза от капката (утайка от концен-
трирания екстракт).
7.3.3. Запечатайте разреза със стерилен вазе-
лин от спринцовка.
7.4. Инокулация със спринцовка
Инокулирайте стъблото на патладжана точно
над котиледоните чрез използване на спринцовка
с игла за подкожна инжекция (не по-малка от 23
G). Разпределете пробата между патладжаните.
7.5. Като положителни контроли инокулирай-
те 5 растения с водна суспензия от 105 до 106 клет-
ки на ml от позната култура на C. m.
subsp.sepedonicus и където е възможно—с естест-
вено заразена тъкан от клубени (виж раздел 4) по
същия инокулационен метод (7.3 или 7.4).
7.6. Като отрицателни контроли инокулирайте
5 растения със стерилен буфер за разтваряне на
утайката, като използвате същия инокулационен
метод (7.3 или 7.4).
7.7. Инкубирайте растенията в карантинни съ-
оръжения до четири седмици при 18 до 24 °C. Ин-
кубирайте растенията при достатъчно светлина и
висока влажност (70 до 80 %), за да предотвратите
полягане или спаружване поради недостиг на вода.
Клетките на C. m. sepedonicus загиват при темпе-
ратура 30 °C, а оптималната температура е 21 °C.
За да избегнете заразяване, инкубирайте растени-
ята от положителната и отрицателната контрола
на ясно разделени маси в оранжерия или вегетаци-
онна камера или в случай че мястото е ограниче-
но, осигурете строго разделяне между третирани-
ята. Ако растенията от различни проби трябва да
бъдат инкубирани близо едно до друго, отделете
ги с подходящи прегради. Когато наторявате, по-
ливате, инспектирате или извършвате някакви
други манипулации, внимавайте изключително
много, за да избегнете кръстосано заразяване. Важ-
но е да се пазят оранжериите и растежните камери
свободни от насекомни вредители, тъй като те
могат да пренесат бактерията от проба на проба.
7.8. Преглеждайте редовно за симптоми, започ-
вайки след една седмица. Преброявайте растения-
та, показващи симптоми.
C. m. subsp.sepedonicus причинява увяхване на
листата при патладжаните, което може да започ-
не като омекване на тъканите по периферията на
листата или между нерватурата. Засегнатата тъ-
кан може първоначално да бъде тъмнозелена или
на петна, но впоследствие избледнява, преди да
некротизира. При увяхване между жилките по-
върхността често изглежда мазна и много водна.
Мъртвата тъкан е често яркожълта по края. Рас-
тенията не загиват непременно. Колкото по-дъ-
лъг е периодът, преди да се развият симптомите,
толкова по-голям е шансът за оцеляване. Расте-
нията могат да превъзмогнат инфекцията. Мла-
дите патладжани са много по-чувствителни към