Държавен вестник, бр. 39, 2006 г., стр. 32

С Т Р .  32
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  39
•
при индиректно маркиране негативните
контролни реагенти включват несъответ-
стващо първо антитяло и съответното
второ антитяло, белязано със същия флу-
орохром, използван в теста;
•
при директно маркиране негативните кон-
тролни реагенти включват несъответст-
ващо антитяло, белязано с използвания в
теста флуорохром;
•
всяка серия от тестове включва позитив-
на серумна контрола, за която е доказано,
че реагира с всички HLA клас I антигени;
•
лабораторията има критерии за разгра-
ничаване на позитивните реакции;
•
в случай че се установи взаимодействие
на моноклоналните антитела с антигени,
различни от специфичните, трябва да съ-
ществува писмен протокол за начина на
разграничаване на специфичен от неспе-
цифичен антиген.
27.12. ДНК анализ:
27.12.1. Лабораторията е в състояние да оп-
ределеля HLA-A, -B, -C, -DR, -DQ, -DP алелите,
официално признати от СЗО.
27.12.2. ДНК е пречистена по стандартен
метод, описан в научната литература и тесту-
ван в лабораторията. Избягва се интерпретаци-
ята на резултата, когато е използвана дегради-
рала ДНК.
27.12.3. Изисква се използването на простран-
ствени и/или биохимични бариери за предотвра-
тяване на ДНК контаминация. Преамплифика-
ционните процедури се извършват на означено-
то работно място, където няма ДНК амплифи-
кати, напр. PCR продукти, плазмиди, съдържа-
щи HLA гени. Препоръчва се пространствено
разделяне и ограничен поток на трафика, както
и използване на ламинарен бокс или биологич-
но безопасна кабина II клас. Могат да бъдат
използвани биохимични процедури за инакти-
виране на амплификационните продукти.
27.12.4. Методи, които използват двустъпал-
на амплификация, предразполагат към греш-
ки, свързани с PCR контаминация. Прибавяне-
то на матрицата за втората амплификация е
разделено физически от преамплификационно-
то и постамплификационното работно място.
Изисква се да се използват определени пипети
на всяко работно място.
27.12.5. Като амплификационна матрица
може да се използва ДНК (от всеки тип ядрена
клетка) или РНК (кДНК) (от всеки тип клетки,
експресиращи HLA антигени). При използване
на РНК е необходимо включването на подходя-
щи контроли за обратната транскрибция.
27.12.6. Използват се праймери с известна
специфичност и секвенция, които могат да оп-
ределят HLA локуса и алела(и).
27.12.7. Всяка нова партида праймери се тес-
тува върху референтен материал за потвърж-
даване на специфичността и количеството на
продукта.
27.12.8. Негативни контроли (без нуклеи-
нови киселини) се включват във всеки ампли-
фикационен тест. Друга негативна контрола
може да включва отворена епруветка на ра-
ботното място.
27.12.9. Лабораторията трябва да има специ-
фични критерии за приемане или отхвърляне
на амплификацията.
27.12.10. В случай че PCR продуктът е кра-
ен резултат от анализа, е необходимо използ-
ването на подходящи позитивни и негативни
контроли за установяване на евентуална не-
успешна амплификация във всяка амплифика-
ционна смес.
27.12.11. Специфичността на използваните
сонди при PCR-SSO метода тестува и потвърж-
дава периодично, като се използва референтен
материал при оптимизирани условия.
27.12.12. Хибридизацията се провежда при
емпирично установени и документирани усло-
вия, осигуряващи специфичността на сондите.
27.12.13. Приемливите граници на силата на
сигнала се определят въз основа на позитивните
и негативните контроли, използвани при всеки
хибридизационен анализ-SCORE система.
27.12.14. Посочва се методът за определяне
на специфичностите.
27.12.15. Препоръчват се две независими ин-
терпретации на резултата.
27.12.16. Записът на резултата включва: вида
анализ, HLA локуса и определените алели съг-
ласно номенклатурата на СЗО.
27.12.17. Матрицата за нуклеотидно секве-
ниране се характеризира със съответна специ-
фичност (напр. локусна или алелна специфич-
ност), количество и качество. Методът за под-
готовка на матрицата трябва да осигурява сек-
венционна матрица с достатъчна дължина, ко-
ято не съдържа инхибитори на секвенционните
реакции и замърсявания и не оказва влияние
върху точността на крайната секвенция (напр.
мутации, възникнали при клониране, преферен-
циална амплификация).
27.12.18. Условията за праймерно удължава-
не (напр. типа полимераза, концентрация на по-
лимеразата, концентрация на нуклеозид три-
фосфатите, концентрация на терминаторите) се
съобразяват с вида на матрицата (напр. дължи-
на на секвенцията, GC съдържание).
27.12.19. Специфичността и чувствителността
на методите за белязване и детекция се доку-
ментират от лабораторията.
27.12.20. Лабораторията въвежда критерии
за приемане на всеки гел и всеки старт от гела.
27.12.21. Трябва да бъдат установени прием-
ливи електрофоретични условия (напр. темпе-
ратура, сила на тока, продължителност на елек-
трофорезата). Условията се документират за
всяка електрофореза. Перманентен запис за
всяка електрофореза (напр. електронен файл,
дискета) се съхранява най-малко в продълже-
ние на две години.