Държавен вестник, бр. 78, 2002 г., стр. 46

С Т Р .  46
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  78
Във всяка плака се аплицира по 75 мкл разреди-
тел във всяка ямка и се накапва в две последовател-
ни ямки по 50 мкл от пробата (серум или плазма).
Компонентите се смесват чрез внимателно
разклащане на плаката и същата се покрива и
инкубира за 90 минути във влажна камера.
Плаката се промива двукратно.
Във всяка ямка на плаката се накапва по 100 мкл
конюгат в разреждане 1:200. Инкубира се при 37 °С
за 30 мин.
Плаката се промива двукратно.
Във всяка ямка се накапва по 100 мкл хромоген.
След като разликата между оптичната плът-
ност на отрицателната и положителната контрола
стане по-голяма или равна на 0,3, реакцията се
отчита със “Санофи” ридер фотометрично (20 до
30 мин след добавянето на хромоген). Преди отчи-
тането реакцията се спира чрез добавяне във всяка
ямка по 50 мкл стопинг-разтвор.
2. ELISA за доказване на антитела срещу CSFV—
Erns (разграничителен тест).
Кратко описание:
Тестът се използва за детекция в серум на анти-
тела срещу Еrns—протеина на вируса на КЧС. Тес-
тът е основан на блокиране чрез специфичните се-
румни антитела на свързването между Еrns—с паци-
фични моноклонални антитела и Еrns—протеина.
Предназначен е за разграничаване на антителата,
образувани след ваксинация с Е-2 субединична вак-
сина, и на тези, образувани след ваксинация с кон-
венционална ваксина или след размножаването на
теренен вирус на КЧС в организма на свинете.
Процедура:
1. Всички реагенти, съдържащи се в кита и до-
пълнителните плаки, се темперират.
2. Референтните серуми се реконституират с
деминерализирана вода.
3. Конският серум, антигенът се реконституи-
рат с дестилирана или деминерализирана вода.
4. Приготвя се ELISA-буфер от предварително
разредения с дестилирана или деминерализирана
вода разтварящ буфер и 5 % конски серум.
5. Антигенът и конюгатът се довеждат до ра-
ботно разреждане с ELISA-буфер.
6. Приготвя се миещ разтвор.
7. Върху допълнителните плаки се диспенси-
рат по 12 мкл ELISA-буфер в А1 и В1 и по 45 мкл
от същия буфер в останалите ямки.
8. В А1 и В1 се диспенсира по 30 мкл от рефе-
рентен серум 1, в С1 и 1—също, в Е1 и F1—30 мкл
от референтен серум 2 и в G1, Н1—по 30 мкл от
референтен серум 3.
9. В ямки от А12 до Н12 се диспенсира по 30 мкл
от 88 изследвани серума.
10. В ямки от С1 до Н12 се диспенсира по 75 мкл
от работния разтвор на антигена, плаката се зат-
варя, разклаща се леко и се инкубира за 30 минути
при 37 °С.
11. След приключване на инкубацията се отва-
рят покритите с антитела ELISA-плаки, диспенси-
рат се по 50 мкл работен разтвор на конюгата във
всички ямки и с помощта на 12-канална пипета се
прехвърлят във всички ямки по 50 мкл от обема на
всички ямки в допълнителните плаки.
12. Плаките се покриват, леко се разклащат и
се инкубират за 1 час при 37 °С.
13. ELISA-плаките се мият 6 пъти с разчет 200—
300 мкл миещ разтвор на ямка. След всеки цикъл
плаките внимателно се затварят.
14. Във всяка ямка се диспенсира по 100 мкл
разтвор на хромоген/субстрат и се инкубира за 30
минути при стайна температура.
15. Реакцията се спира чрез добавяне на 100 мкл
стоп-разтвор във всяка ямка.
16. Реакцията се отчита не по-късно от 15 мин
след добавянето на стоп-разтвор. Измерва се оп-
тичната плътност на всяка ямка и резултатите се
калкулират по указана от производителя формула.
Валидация и интерпретация на резултатите
Тестът е валиден при ODmax
най-малко1.000.
Стойността на blank OD450
по-малко от 0.150.
Процент инхибиция на референтен серум 2 по-
голяма от 50 %.
Процент инхибиция на референтен серум 3 по-
малка от 50 %.
Като положителни (има наличие на специфич-
ни антитела срещу протеин Еrns на вируса на КЧС)
се определят всички серуми със стойности на про-
цент инхибиция по-големи от 50 %.
Като отрицателни (няма наличност на специ-
фични антитела срещу протеин Еrns на вируса на
КЧС) се определят всички серуми със стойности
на процент инхибиция по-малки от 50 %.
Приложение № 2
към чл. 8, т. 2, буква “г”
Дезинфекция при класическа чума по свинете
1. След освобождаване на помещенията в сви-
невъдните обекти от свине подовете, хранилките,
торът и околният терен се накисват с двупроцен-
тов разтвор на натриева основа при разход 1 л/м2  и
експозиция 24 часа.
2. След обработката по т. 1 се извършва меха-
нично почистване и измиване на помещенията с
вода, смесена с детергент, с температура на разт-
вора 70 °С и налягане на струята 80—150 атм. По-
чистването продължава до пълното измиване на
повърхностите, като отточните води не трябва да
съдържат видими замърсявания.
3. В единия край на терена в границите на сви-
невъдния обект се изкопава траншея с дълбочина
не по-малко от 2 м, в която се изхвърля торът от
помещенията и торището, торовата течност, пос-
телята, остатъците от фураж, малоценни и малот-
райни предмети. Те се натрупват до 1 м над повър-
хността на траншеята, като равномерно се приба-
вя вирузан и отгоре се насипва 50 см пласт от пръст.
4. Отточните води от свиневъдния обект се
обезвреждат чрез събиране в траншея и добавяне
на 160 кг гасена вар на 1 м3 течност при експози-
ция най-малко 48 часа.
5. Когато отточните води се изливат в канали-
зацията, в нея се поставя варел с вместимост 10 л,
съдържащ твърда натриева основа.
6. След механичното почистване и измиването
се извършва основна дезинфекция на помещения-
та с едно от следните дезинфекционни средства:
а) 2 %-ов разтвор на натриева основа при раз-
ход 1 л/м2 и експозиция 6 часа;
б) 5 %-ов разтвор на хлорамин при разход 1 л/м2
или суха хлорна вар по 100—200 г/м2 и експозиция
6 часа, с активиране с амониева селитра или супер-
фосфат, по 50—100 г/м2, при вземане на мерки за
недопускане обгазяването на хора;
в) 5 %-ови разтвори на формалинови препара-
ти (фезиаформ, вераформ, формазол) при разход
1 л/м2, температура на разтвора 15 до 30 °С и екс-
позиция 6 часа;
г) газов аерозол от формалдехид, получен при
смесване на формалин, калиев перманганат и вода
в съотношение съответно 25 мл, 17,5 г и 12,5 мл и
експозиция 12 часа.