Държавен вестник, бр. 68, 2014 г., стр. 41

БРОЙ  68	
Д Ъ Р Ж А В Е Н  В Е С Т Н И К 	
СТР.  41  
Ако концентрацията на една или повече суб­
станции в пробата е много висока, пробата се 
разрежда и определението се повтаря.
Забележки:
1. о-ФДА се проявява слабо; трябва да се 
използва подвижна фаза (т. 3.22.3), за да се раз­
граничи ясно от о-ТДА.
2. (*) показва най-добро развитие на цвета.
6. Изпитване с двупосочна тънкослойна хро­
матография
Двупосочната хроматографска процедура 
изисква употребата на допълнителни стандарти 
и реактиви.
6.1. Допълнителни стандартни разтвори и 
субстанции
6.1.1. β-нафтол (β-Н).
6.1.2. 2-аминофенол (о-АФ).
6.1.3. 3-аминофенол (м-АФ).
6.1.4. 4-аминофенол (п-АФ).
6.1.5. 2-нитро-1,4-фенилендиамин (2-НПФДА).
6.1.6. 4-нитро-1,2-фенилендиамин (4-НОФДА).
Приготвят се 0,5 % (M/V) разтвори на всички 
допълнителни стандартни субстанции, както е 
описано в т. 3.21.
6.2. Допълнителна подвижна фаза
6.2.1. Етилацетат : циклохексан : амонячен 
разтвор (25 %) = 65 : 30 : 0,5 (V/V/V).
6.3. Допълнителна индикаторна система за 
проявяване на петната
Във ваната за тънкослойна хроматография 
се поставя стъклен съд с 2,0 g йодни кристали 
и ваната се затваря с подходящ капак.
6.4. Хроматографиране
6.4.1. Върху абсорбиращата повърхност на 
плаката за тънкослойна хроматография (т. 4.1.3) 
се начертават две линии, както е показано на 
фиг. 1.
6.4.2. Под азотна атмосфера (т. 4.1.1) се на­
насят от 1 до 4 µl от екстракта на пробата на 
стартова точка 1 (фиг. 1), която е на 2 сm от 
двете страни на плаката.
Количеството на нанесения екстракт зависи 
от интензивността на петната върху хроматогра­
мите (т. 5.2).
Фиг. 1
6.4.3. Нанасят се на стартови точки 2 и 3 
(фиг. 1) окислителните багрила, които са иден­
тифицирани или предстои да се идентифицират 
чрез т. 5.2 (разстоянието между точките е 1,5 cm). 
От всички стандартни разтвори се нанасят по 
2,0 µl, с изключение на ДАФ – от него трябва 
да се нанесат 6,0 µl. Нанасянето се провежда 
под азот (т. 6.4.2).
6.4.4. Повтаря се операция (т. 6.4.3) за стартови 
точки 4 и 5 (фиг. 1) – разстояние между точките 
1,5 cm, и се оставя плаката под азот до момента 
на хроматографиране.
6.4.5. Хроматографската вана се продухва с 
азот (т. 3.8) и се насища с подвижна фаза (т. 3.22.2).
Плаката (т. 6.4.4) се поставя във ваната в 
първата посока (фиг. 1) на тъмно.
Хроматографирането продължава, докато 
фронтът на подвижната фаза достигне маркира­
ната линия върху плаката (приблизително 13 cm).
6.4.6. Плаката се изважда от ваната и се по­
ставя в друга, предварително продухана с азот, 
където престоява поне 60 min, за да се изпарят 
разтворителите.
6.4.7. В следваща хроматографска вана, също 
предварително продухана с азот (т. 3.8) и наси­
тена с подвижна фаза (т. 6.2), плаката се поставя 
обърната на 90°.
Хроматографира се във втората посока (също 
на тъмно), докато фронтът на подвижната фаза 
достигне начертаната линия върху абсорбира­
щата повърхност (фиг. 1), след което се изважда 
от ваната и се оставя на въздух да се изпарят 
разтворителите.
6.4.8. Плаката се поставя за 10 min в хрома­
тографската вана с йодни пари (т. 6.3). Двупосоч­
ната хроматограма се тълкува, като се използват 
Rf стойностите и цветът на стандартните суб­
станции, хроматографирани по същото време. 
В табл. 2 са посочени цветовете на петната на 
стандартните субстанции.
Забележка. За да се получи максимално оц­
ветяване на петната, хроматограмата се оставя 
на въздух за половин час след проявяване на 
петната.
6.4.9. Наличието на окислителни багрила, 
открити в т. 6.4.8, може окончателно да се по­
твърди с повторение на операциите, описани в 
т. 6.4.1 до т. 6.4.8, и добавяне в стартова точка 
1, върху количеството нанесена проба (т. 6.4.2), 
на 1 µl от стандартните разтвори, идентифици­
рани в т. 6.4.8.
Ако не се открие друго петно, сравнено с 
получената хроматограма в т. 6.4.8, тълкуването 
є е правилно.
Таблица 2
Цвят на петната на стандартните субстанции 
след хроматографиране и проявяване с йодни пари
Стандартна
субстанция
Цвят след проявяване 
с йодни пари
Р
Бежов
П
Кафяв
α-Н
Виолетов
β-Н
Бледокафяв
Х
Виолетово-кафяв