Държавен вестник, бр. 68, 2010 г., стр. 109

БРОЙ  68	
Д Ъ Р Ж А В Е Н  В Е С Т Н И К 	
СТР.  109  
• серумните контроли включват и два серума 
за всеки антиген, реагиращ кръстосано със спе­
цифичния;
• серумите за дефиниране на всеки антиген 
съответстват на изискванията за серологично HLA 
типизиране.
29.6.9.3. При флоуцитометричния тест: 
• във всеки тест се използва негативна контро­
ла, включваща моноклонално антитяло/антитела 
от същия вид и субклас, като моноклоналите, 
използвани за фенотипизиране; 
• при индиректно маркиране негативните кон­
тролни реагенти включват несъответстващо първо 
антитяло и съответното второ антитяло, белязано 
със същия флуорохром, използван в теста;
• при директно маркиране негативните контрол­
ни реагенти включват несъответстващо антитяло, 
белязано с използвания в теста флуорохром;
• всяка серия от тестове включва позитивна 
серумна контрола, за която е доказано, че реагира 
с всички HLA клас I антигени;
• лабораторията трябва да има критерии за 
разграничаване на позитивните реакции;
• в случай че се установи взаимодействие на 
моноклоналните антитела с антигени, различни 
от специфичните, трябва да съществува писмен 
протокол за начина на разграничаване на специ­
фичен от неспецифичен антиген.
29.7. ДНК анализ:
29.7.1. Всички преамплификационни процедури 
се извършват само на определени за целта работни 
места. Препоръчителни са пространствено разде­
ляне и ограничен поток на трафика.
29.7.2. В преамплификационната зона се из­
ползват само определени за целта оборудване, 
консумативи и лабораторно облекло.
29.7.3. Всички дейности, произтичащи от и 
включващи амплификация в PCR апаратите, се 
извършват в постамплификационната зона. 
29.7.4. Методи, които използват двустъпал­
на амплификация, предразполагат към грешки, 
свързани с PCR контаминация. Прибавянето на 
матрицата за втората амплификация е разделено 
физически от преамплификационното и постамп­
лификационното работно място. Изисква се да се 
използват определени оборудване и консумативи.
29.7.5. Контрол за замърсяване („wipe-test“).
29.7.5.1. Замърсяване се проследява при всички 
амплификационни процедури.
29.7.5.2. Рутинен wipe-test на преамплификаци­
онната зона и оборудване се извършва най-малко 
1 път на всеки 2 месеца. Тестуване на другите зони 
е препоръчително. 
29.7.5.3. Мониторирането на замърсяване се 
извършва по методи с чувствителност, съответ­
стваща на рутинно използваните методи.
29.7.6. Оборудване и реактиви
29.7.6.1. Точността на PCR апаратите се вери­
фицира чрез: поддръжка съобразно препоръките 
на производителя; проверка на функционирането 
на всеки апарат на 6-месечни интервали.
29.7.6.2. Инкубаторите и водните бани се кон­
тролират при всеки анализ.
29.7.6.3. Преди използване в рутинната работа 
всяка нова партида от реактивите и търговските 
китове се тестува.
29.7.6.4. За търговските китове се документират 
производител, партиден номер, срок на годност и 
условия на съхранение. 
29.7.7. Праймери и сонди
29.7.7.1. Специфичностите на праймерите и 
сондите, позициите на праймерите и таргетните 
секвенции на сондите се документират. 
29.7.7.2. Всеки партиден номер трябва да бъде 
тестуван върху поне една ДНК проба с известна 
специфичност. Интензитетът на сигнала трябва да 
бъде дефиниран, мониториран и да съответства 
на приемливото ниво.
29.7.7.3. Праймерите и сондите се използват 
при емпирично определени условия, осигуряващи 
специфичност в рутинното тестуване. 
29.7.8. Изолиране на ДНК, електрофореза и 
анализ
29.7.8.1. Изолиране на ДНК
29.7.8.1.1. ДНК се изолира и пречиства по стан­
дартен метод, който е документиран и валидиран 
в лабораторията.
29.7.8.1.2. Ако ДНК не се използва веднага след 
пречистване, лабораторията трябва да разполага 
с метод за съхранение, който запазва материала 
от деградиране.
29.7.8.1.3. ДНК трябва да бъде с достатъчна 
чистота и концентрация за осигуряване на на­
деждни резултати. 
29.7.8.2. Електрофореза
29.7.8.2.1. Трябва да бъдат определени и доку­
ментирани оптимални електрофоретични условия 
и приемливи граници.
29.7.8.2.2. Лабораторията установява критерии 
за приемане на всеки старт или капилярна гелна 
миграция.
29.7.8.2.3. Когато размерът на ампликона е 
критичен фактор при анализа, във всеки гел се 
включва маркер с размер на фрагментите, съот­
ветстващ на всички очаквани фрагменти.
29.7.8.3. Анализ
29.7.8.3.1. Приемливи граници на силата на 
сигнала се дефинират за определяне на позитивен 
и негативен резултат.
29.7.8.3.2. При мануално отчитане на позитивни/ 
негативни реакции и определяне на алелите при 
SSP и SSOP методите се извършват 2 независими 
интерпретации на първичните данни. При спешни 
ситуации е допустима 1 интерпретация. 
29.7.8.3.3. Методът за определяне на алелите и 
алелната база данни се документират. 
29.7.8.3.4. При неразграничим резултат всич­
ки възможни алелни комбинации се посочват в 
резултата.
29.8. Методи за типизиране
29.8.1. PCR-SSP
29.8.1.1. Всяка ампификационна реакция включ­
ва контрола за детекция на технически пробле­
ми – вътрешна контрола (допълнителни праймери 
или матрица, които дават продукт, разграничим 
от специфичния амплификат).
29.8.1.2. При липса на специфичен амплификат 
и вътрешна контрола за дадена праймерна смес 
лабораторията трябва да има политика за приемане 
или отхвърляне на резултатите от типизирането.