Държавен вестник, бр. 8, 2004 г., стр. 20

С Т Р .  20
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  8
8.1.2. Изчислява се фосфатазната активност в
µg фенол/ml възстановено мляко съгласно следна-
та формула:
Фосфатазна активност = 2,4 Ч Р,
където Р е количеството фенол (µg) съгласно т. 8.1.1.
8.1.3. Ако е било необходимо разреждане, как-
то е посочено в т. 6.2.10, полученият резултат в
т. 8.1.2 се умножава с фактора на разреждане.
8.2. Повторяемост
Разликата между резултатите от два анализа,
проведени едновременно или в бърза последова-
телност на една и съща проба, от един и същ лабо-
рант, при еднакви условия, не трябва да превишава
2 µg освободен фенол на 1 ml възстановено мляко.
IХ. Метод 8. Определяне на фосфатазната ак-
тивност (процедура на Aschaffenburg и Mьllen)
1. Обхват и сфера на приложение
С този метод се определя фосфатазната актив-
ност на млеката по чл. 9—12.
2. По смисъла на този метод “фосфатазна ак-
тивност на сухите млека” е показател за количес-
твото на наличната активна алкална фосфатаза.
Тя се изразява като количество p-нитрофенол (µg),
освободен от 1 ml възстановена проба, както е
описано в съответния специфициран метод.
3. Принцип на работа
Възстановената проба се разрежда с буферен
субстрат при pH 10,2, загрява се при температура
37 °C за 2 h. При тези условия цялата налична ал-
кална фосфатаза в пробата освобождава p-нитро-
фенол в резултат на прибавения динатриев р-нит-
рофенил фосфат. Освободеният р-нитрофенол се
определя чрез директно сравняване със стандарт-
ните цветни стъкла в прост калибратор чрез из-
ползване на отразена светлина.
4. Реактиви
4.1. Буферен разтвор на натриев карбонат-би-
карбонат
Разтварят се 3,5 g дехидриран натриев карбо-
нат и 1,5 g натриев бикарбонат във вода и се раз-
реждат с вода в обемна колба до 1000 ml.
4.2. Буферен субстрат
Разтварят се 1,5 g двунатриев р-нитрофенилфос-
фат в буферния разтвор натриев карбонат-бикарбо-
нат (т. 4.1) и се разреждат в обемна колба с буфер
(т. 4.1) до 1000 ml. Този разтвор е стабилен за срок от
един месец, ако се съхранява в хладилник (І 4 °С), но
трябва да се провежда тест за контрол относно цвета
на такива разтвори (т. 6—предпазна мярка 3).
4.3. Избистрящи разтвори
4.3.1. Разтвор на цинков сулфат
Разтварят се 30,0 g цинков сулфат (ZnSO4) и се
разреждат в обемна колба с вода до 1000 ml.
4.3.2. Разтвор на калиев фероцианат (II)
Разтварят се 17,2 g калиев фероцианат (II) три-
хидрат [K4Fe(CN)6.3Н2О] и се разреждат в обемна
колба с вода до 100 ml.
5. Апаратура
5.1. Аналитична везна
5.2. Водна баня—термостатично контролирана
при 37 °С ± 1 °С.
5.3. Уред за сравняване със стандартен обра-
зец, снабден със специален диск с цветни стъкла,
калибрирани в µg р-нитрофенол/ml мляко и с клет-
ки 2 Ч 25 mm.
6. Начин на работа
Предпазни мерки:
1. След използване епруветките трябва да се
изпразнят, да се изплакнат с вода, да се измият с
топла вода, съдържаща алкален миещ препарат, след
което да се изплакнат с чиста топла чешмяна вода,
накрая да се изплакнат с вода и да се подсушат.
Пипетите трябва да се изплакнат със студена
чешмяна вода веднага след употреба, последвано от
изплакване с вода и подсушаване преди употреба.
2. Запушалките на епруветките трябва да се
изплакнат с топла чешмяна вода веднага след упо-
треба, след което се изваряват във вода за 2 min.
3. Разтворът на буферния субстрат (т. 4.2) може
да остане стабилен най-малко един месец, ако се
съхранява в хладилник при температура не по-ви-
сока от 4 °С. Нестабилността му се изразява с по-
явата на жълто оцветяване. Макар че изпитването
винаги се отчита спрямо вряща контрола, съдър-
жаща същия разтвор на буферен субстрат, препо-
ръчва се да не се използва разтворът, ако той дава
отчитане на цвета повече от 10 µg при отчитане на
25 mm клетка в уред за сравняване със стандартен
образец при използване на дестилирана вода в
другата 25 mm клетка.
4. За всяка проба трябва да се използва отделна
пипета, като се избягва замърсяването є със слюнка.
5. Пробата не трябва да бъде излагана на ди-
ректна слънчева светлина.
6.1. Подготовка на пробата
Разтварят се 10 g от продукта в 90 ml вода. Тем-
пературата на разтваряне не трябва да е по-висока
от 35 °С.
6.2. Определяне
6.2.1. С пипета се поставят 15 ml от буферния
субстрат (т. 4.2) в чиста и суха епруветка, последва-
но от 2 ml от възстановената проба (т. 6.1), която ще
бъде изпитвана. Епруветката се затваря със запу-
шалка, съдържанието се хомогенизира чрез обръ-
щане и се оставя на водна баня при 37 °С (т. 5.2).
6.2.2. В същото време на водна баня се поставя
контролна епруветка, съдържаща 15 ml от буфер-
ния субстрат и 2 ml от заврялата възстановена
проба, подобна на изпитваната.
6.2.3. Двете епруветки се махат от водната баня
след 2 h и към тях се добавя 0,5 ml цинков сулфат
като утаител (т. 4.3.1). Епруветката се запушва,
разклаща се енергично и се оставя в покой за 3 min.
Добавят се 0,5 ml калиев фероцианат (II) утаител
(т. 4.3.2), размесва се добре и се филтрира през
фуния с филтърна хартия (т. 5.4). Прозрачният
филтрат се събира в чиста епруветка.
6.2.4. Филтратът се прехвърля в 25 mm клетка
и се сравнява с филтрата на кипналата контролна
проба в уреда за сравняване, като се използва спе-
циален диск (т. 5.3).
7. Изразяване на резултатите
7.1. Изчисляване
Директното отчитане, получено в т. 6.2.4, се
записва като µg р-нитрофенол/ml проба или на
милилитър от възстановената проба.
7.2. Повторяемост
Разликата между резултатите от два анализа,
проведени едновременно или в бърза последова-
телност на една и съща проба, от един и същ лабо-
рант, при еднакви условия, не трябва да превиша-
ва 2 µg освободен р-нитрофенол на 1 ml възстано-
вено мляко.
3070