Държавен вестник, бр. 109, 2002 г., стр. 59

Б Р О Й  109
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
С Т Р .  59
Ниво на авопарцина в
5
7,5
10 15
20
40
(mg/kg)
Тегло на пробата
50
50
50 50
50
50
(g(± 0,1g))
Количество на разтвора
100 100
100 100
100 100
(4.6)( ml)
Обем на чистия екстракт
20
15
20 15
20
10
Краен обем
25
25
50 50
100 100
Очаквана концентрация
2
Прибл. 2 2
Прибл.2 2
2
(mg/ml)
7. Процедура на анализиране на пробата
7.1. Посявка върху средата на пробата
Приготвя се посявка на пробната среда (4.1)
със съдържащата спори суспензия (3.2) при тем-
пература 50 до 60°С. Посредством предварител-
ни опити върху панички с пробна среда (4.1) се
определя количеството суспензия със спори,
което е необходимо за получаването на макси-
мално големи и чисти зони на инхибиране, при
различните концентрации на авопарцин.
7.2. Подготвяне на паничките
Дифузията през агара се осъществява в па-
нички с четирите концентрации на стандарт-
ния разтвор (S8, S4, S2, S1) и четирите концент-
рации на пробния разтвор (U8, U4, U2, U1). Тези
четири концентрации на екстракта и стандарта
е необходимо да се поставят във всяка паничка.
За тази цел се избират достатъчно големи панич-
ки, които да позволят да бъдат направени поне
осем отвора с диаметър 10 до 13 mm при разсто-
яние не по-малко от 30 mm между центровете в
средата от агар. Опитът се извършва върху па-
нички, състоящи се от лист стъкло с покрит алу-
миний или пластмасов пръстен, поставен отгоре,
с диаметър 200 mm и височина 20 mm.
В паничките се налива количество от среда-
та (4.1), върху което е било направена посявка
в съответствие с т. 7.1, така че да се получи слой
с дебелина около 2 mm (60 mm за паничка с
дебелина 200 mm). Оставя се така, че да застане
в равна позиция, пробиват се отворите и в тях се
поставят точно измерени обеми от пробата и
стандартните разтвори (между 0,710 и 0,715 ml
на отвор, в зависимост от диаметъра). Всяка
концентрация се прилага поне четири пъти, така
че всяко определяне да бъде обект на оценява-
нето на 32 зони на инхибиране.
7.3. Инкубация (престояване)
Паничките се оставят да престоят в продъл-
жение на 16 до 18 h при температура 30°С.
8. Оценка
Измерва се диаметърът на зоните на инхи-
биране до най-близките 0,71 mm. Записват се
средните измервания за всяка концентрация
върху хартия за полулогаритмична графика
(милиметрова), която показва логаритъма на
концентрациите в съотношение с диаметрите
на зоните на инхибиране. Изчертават се линиите
на “най-добро напасване” както на стандарт-
ния разтвор, така и на екстракта.
Пунктът на “най-добро напасване” за стан-
дартното най-ниско ниво (SL) се определя по
формулата:
7S1 + 4S2 + S4—2S8
SL = –––––––––––  (1)
10
Пунктът на “най-добро напасване” за стан-
дартното най-високо ниво (SН) се определя по
формулата:
7S8 + 4S4 + S2—2S1
SH = –––––––––––  (2)
10
Аналогично се изчисляват точките на “най-
добро напасване” за най-ниското ниво на
екстракта (UL) и за най-високото ниво на екс-
тракта (UH), като се заместят U1, U2, U4 и U8 с
S1, S2, S4 и S8 в посочените формули.
Изчислените стойности на SL и SH се замес-
тват върху млиметрова хартия и се свързват така,
че да се получи линията на “най-добро напасва-
не” за стандартния разтвор. Аналогично се за-
писват стойностите на UL и UH и се свързват
така, че да се получи линията на “най-добро
напасване” за екстракта.
В случай че липсва каквото и да е смущение,
линиите трябва да са успоредни. За целите на
практиката линиите могат да се приемат за
успоредни при положение, че стойностите (SH-
SL) и (UH-UL) не се различават с повече от
10 % от техните средни стойности.
Ако се установи, че линиите не са успоред-
ни, то или U1 и S1, или U8 и S8 могат да се отхвър-
лят и да се изчислят SL, SH, UL и UH, като се
използват алтернативните формули, така че да
се получат линии на “най-добро напасване”:
5S1 + 2S2—S4
5S2 + 2S4—S8
SL = –––––––– или ––––––––   (3)
6
6
5S4 + 2S2—S1
5S8 + 2S4—S2
SH = –––––––– или ––––––––  (4)
6
6
и аналогично за UL и UH. Алтернативните
линии на “най-добро напасване” се проверяват
за успоредност, така както е показано тук, по-
горе. В крайния отчет се отбелязва фактът, че
резултатът е бил изчислен на база трите нива.
Ако се приеме, че линиите са успоредни,
тогава се изчислява логаритъмът на относител-
ната активност (логаритъм А) посредством една
от следните формули:
За четири нива—
(U1 + U2 + U4 + U8—S1—S2—S4—S8) . 0,602
Log A=–––––––––––––––––––––––––   (5)
U4 +U8 + S4 + S8 —U1—U2—S1—S2
За три нива—
(U1 + U2 + U4—S1—S2—S4) . 0,401
Log A=––––––––––––––––––––––   (6)
U4 + S4—U1—S1
или
(U2 + U4 + U8—S2—S4—S8) . 0,401
Log A=––––––––––––––––––––––   (7)
U8 + S8—U2—S2