Държавен вестник, бр. 28, 2007 г., стр. 47

Б Р О Й  28
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
С Т Р .  47
а) Валидни резултати от FISH теста се получа-
ват, когато се наблюдават яркозелени флуоресци-
ращи клетки с размер и морфология, типични за
R. solanacearum, когато се използва FITC филтър,
и яркочервени флуоресциращи клетки, когато се
използва родаминов филтър, във всички положи-
телни контроли и нито в една отрицателна конт-
рола. При откриване на светли флуоресциращи
клетки с характерна морфология се определя сред-
ният брой на типични клетки за микроскопско поле
и се изчислява броят на типичните клетки за ml
разтворена утайка (Допълнение 4). Пробите с поне
5 Ч 103 типични клетки за ml разтворена утайка се
считат за потенциално заразени. Налага се допъл-
нително изпитване. Пробите с по-малко от 5 Ч 103
типични клетки за ml разтворена утайка се считат
за отрицателни.
б) FISH тестът е отрицателен, когато не се наб-
людават яркочервени флуоресциращи клетки с
размер и морфология, типични за R. solanacearum,
когато се използва родаминов филтър при усло-
вие, че се наблюдават типични яркочервени флу-
оресциращи клетки в положителните контроли,
когато се използва родаминов филтър.
8. ЕLISA тестове
Принцип
Поради сравнително ниската чувствителност
на ЕLISA теста той може да се използва само като
допълнителен тест към IF, PCR и FISH. Когато се
използва DAS ЕLISA задължително се прави обо-
гатяване и се използват моноклонални антитела
(виж интернет страница http://forum.europa.eu.int/
Public/irc/sanco/Home/main). Обогатяването на про-
бите, преди да се използва ЕLISA, може да е полез-
но като начин за увеличаване на чувствителност-
та на теста, но може да се провали поради конку-
риране от страна на други организми в пробата.
Забележка. Използва се утвърден източник на
антитела на R. solanacearum (виж интернет стра-
ница http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/
Home/main). Препоръчва се за всяка нова партида
антитела да се определи титърът. Титър е най-
високото разреждане, при което се осъществява
оптимална реакция при тестването на суспензия,
съдържаща 105 до 106 клетки на ml от хомоложния
щам на R. solanacearum, като се използват подхо-
дящи конюгатни съединения на вторични антите-
ла в съответствие с указанията на производителя.
По време на тестването антителата трябва да се
използват при работно разреждане, близко до или
равно на титъра на търговската рецептура.
Определя се титърът на антителата върху бак-
териална суспензия, съдържаща 105 до 106 клетки
на ml от хомоложния щам на R. solanacearum.
Включва се екстракт от проби, които са дали
отрицателен резултат за R. solanacearum при пре-
дишно изпитване, и суспензия на бактерия без
кръстосано действие във фосфатен физиологичен
буфер (PBS) като отрицателни контроли.
Като положителни контроли се използват али-
квоти от екстракт от проби, които при предходно
изпитване са дали отрицателни резултати, смесе-
ни с 103 до 104 клетки на ml щам на R. solanacearum
биовар 2 (например щам NCPPB 4156 = PD 2762 =
= CFBP 3857, виж Допълнение 2А и Б). За сравня-
ване на резултатите във всяка петри се използва
стандартна суспензия, съдържаща 105 до 106 клет-
ки на ml в PBS на R. solanacearum. Осигурява се
отделяне на положителните контроли от пробата/
те за тестване.
Стандартизираните положителни и отрицател-
ни контролни, които могат да се използват за този
тест, са изброени в Допълнение 3А.
Контролният материал се тества по същия на-
чин като пробата/те.
Валидирани са два ЕLISA протоколи:
(а) Индиректна ЕLISA (Robinson Smith et al.,
1995)
1) Използват се 100 до 200 µl количества от
екстракт на пробата. (Загряването при
100 °С за четири минути във водна баня
или загряващ блок може да намали не-
специфичните резултати в някои случаи).
2) Прибавя се равен обем coating буфер (До-
пълнение 4) и се разбърква на Vortex.
3) Поставят се по 100 µl най-малко в две гнез-
да на многоканална плака (например
Nunc-Polysorp или подобни) и се инкуби-
ра за един час при 37 °С или за едно дено-
нощие при 4 °С.
4) След инкубация концентрираният екс-
тракт се отстранява от плаката, като гнез-
дата се промиват трикратно с PBS-Tween
(Допълнение 4).При последното проми-
ване миещият разтвор се оставя в гнез-
дата най-малко пет минути.
5) Приготвя се подходящо разреждане на
антитела за R. solanacearum в блокиращ
буфер (Допълнение 4). За валидираните
комерсиални антитела се използват пре-
поръчаните от фирмата разреждания
(обикновено два пъти по-концентрира-
ни от титъра).
6) Поставят се по 100 µl от разредения ан-
тисерум във всяко гнездо и се инкубира
за един час при 37 °С.
7) Отстранява се антисерумът от гнездата
на плаката и се измива, както е описано
в т. 4).
8) Приготвя се подходящо разреждане на
вторичното антитяло на алкално-фосфа-
тазен конюгат в блокиращ буфер. Поста-
вят се по 100 µl във всяко гнездо на плака-
та и се инкубира за един час при 37 °С.
9) Отстранява се конюгатът от плаката и
се измива, както е описано в т. 4).
10)Прибавя се по 100 µl разтвор на субстрат
на алкална фосфатаза (Допълнение 4) във
всяко гнездо. Инкубира се на тъмно при
стайна температура и се отчита абсорб-
ция при 405 nm на равни интервали в
рамките на 90 минути.
(б) DAS ЕLISA
1) Приготвя се подходящо разреждане на по-
ликлонален антисерум за R. solanacearum
в coating буфер с pH 9,6 (Допълнение 4).
Поставят се по 200 µl във всяко гнездо.
Плаката се инкубира при 37 °С за четири
до пет часа или при 4 °С—за 16 часа.
2) Гнездата се измиват трикратно с PBS-
Tween (Допълнение 4).