Държавен вестник, бр. 27, 2007 г., стр. 21

Б Р О Й  27
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
С Т Р .  21
5. Тест FISH
Принцип
Когато се използва тест FISH като първи скри-
нингов тест и даде положителен резултат, то тряб-
ва да се извърши имунофлуоресцентният тест като
втори задължителен скринингов тест. Когато се
използва тест FISH като втори скринингов тест и
даде положителен резултат, се изисква по-ната-
тъшно тестване съгласно диаграмата, за да се за-
върши диагностиката.
Забележка.
Използвайте валидирани специфични олиго-
сонди от C. m. subsp. sepedonicus (Допълнение 7).
Предварително тестване с този метод би трябвало
да позволи възпроизводимо откриване на поне 103
до 104 клетки от C. m. subsp. sepedonicus на ml екс-
тракт/извлек от пробата, която преди това е била
отрицателна.
Следната процедура трябва с предимство да бъде
изпълнявана на прясно приготвен екстракт от
пробата, но може също да бъде изпълнена и на
екстракт от проба, който е бил съхраняван в гли-
церол при—16 до—24 °C или—68 to—86 °C.
Като отрицателни контроли използвайте част
от предварително разделения на равни части екс-
тракт от пробата, които преди това са дали отри-
цателни резултати за C. m. subsp. sepedonicus.
Като положителни контроли пригответе су-
спензии, съдържащи 105 до 106 клетки на ml от C. m.
subsp. sepedonicus (напр. щам NCPPB 4053 или PD
406) в 0,01 M фосфатен буфер (PB) от три- до пет-
дневна култура (за приготвяне виж Допълнение
2). Изгответе отделни стъкла с положителни кон-
троли от хомоложен щам или от някой друг рефе-
рентен щам на C. m. subsp. sepedonicus, суспенди-
ран в картофен извлек/екстракт, както е описано в
Допълнение 2.
Използването на етикетирана с FITC еубакте-
риална олигопроба предлага контрола за хибриди-
зационния процес, тъй като ще оцвети всички еу-
бактерии, които са налични в пробата. Тествайте
контролния материал по същия начин като проба-
та(ите).
5.1. Фиксиране на картофения екстракт
Следният протокол се базира на Wullings et al.,
(1998):
5.1.1. Изгответе фиксационен разтвор (виж
Допълнение 7).
5.1.2. Пипетирайте 100 µl от всеки екстракт от
проба в Епендорф епруветка и центрофугирайте
8 min при 7000 g.
5.1.3. Отстранете супернатантата и разтворете
утайката в 500 µl от фиксационния разтвор, при-
готвен преди по-малко от 24 h. Разбъркайте и ин-
кубирайте една нощ при 4 °C.
Алтернативен фиксатор е 96 % етанол. За да го
използвате, разтворете утайката от стъпка 5.1.2 в
50 µl 0,01 M PB и 50 µl 96 % етанол. Разбъркайте
сместа и инкубирайте при 4 °C 30 до 60 min.
5.1.4. Центрофугирайте 8 min при 7000 g, отст-
ранете супернатанта и ресуспендирайте утайката
в 75 µl 0,01 M PB (виж Допълнение 3).
5.1.5. Капнете 16 µl от фиксираната суспензия
на чисто предметно стъкло за многократно тест-
ване, както е показано на фиг. 3. Нанесете 2 раз-
лични проби на стъкло, неразредени и използвай-
те 10 µl за да направите разтвор 1:100 (в 0,01 M PB).
Оставащият разтвор от пробата (49 µl) може да
бъде съхранен при—20 °C след прибавяне на 1 обем
от 96 % етанол. В случай, че тестът FISH изисква
повторение, отстранете етанола чрез центрофуги-
ране и добавете равен обем 0,01 M PB (смесете
чрез разбъркване).
Фиг. 3. Постановка за FISH стъкло
Проба 1
Празно
Празно
Празно
Проба 2
Прозорче 1 Прозорче 2
Прозорче 3
Прозорче 4
Прозорче 5
Проба 1
Празно
Празно
Празно
Проба 2
Прозорче 6 Прозорче 7
Прозорче 8
Прозорче 9 Прозорче 10
Покривно стъкло 1
Покривно стъкло 2
5.1.6. Изсушете на въздух стъклата (или в су-
шилня за препарати при 37 °C) и ги фиксирайте
чрез опламеняване.
На този етап процедурата може да бъде пре-
късната и хибридизацията продължена на следва-
щия ден. Стъклата трябва да бъдат съхранявани
далеч от прах и сухи при стайна температура.
5.2. Прехибридизация и хибридизация
5.2.1. Пригответе лизозимен разтвор, съдър-
жащ 10 mg лизозим (Sigma L—6876) в 10 ml бу-
фер (100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0). Този
разтвор може да се съхранява, но трябва да бъде
замразяван и размразяван само веднъж. Покрий-
те всяка проба добре с приблизително 50 µl лизо-
зимен разтвор и инкубирайте 10 min на стайна
температура. След това потопете препаратите в
деминерализирана вода само веднъж и изсушете
с филтърна хартия.
Алтернативно вместо лизозим прибавете 50 µl
от 40 до 400 µg ml—1 протеиназа K в буфер (20 mM
Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7,4) във всяко кладенче
и инкубирайте при 37 °C за 30 min.
5.2.2. Дехидратирайте клетките в степенувани
серии етанол от 50 %, 80 % и 96 % за по една ми-
нута всяка. Изсушете на въздух стъклата в постав-
ка за препарати.
5.2.3. Пригответе влажна инкубационна каме-
ра чрез покриване на дъното на херметична кутия
с тъкан или филтърна хартия, напоена в 1 Ч хиб-
микс (Допълнение 7). Предварително инкубирай-
те кутията в хибридизационна пещ при 55 °C за
поне 10 min.
5.2.4. Пригответе хибридизационен разтвор
(Допълнение 7), позволяващ 45 µl на предметно
стъкло и предварително инкубирайте за 5 min при
55 °C.
5.2.5. Поставете стъклата на котлон при 45 °C
и сложете 10 µl от хибридизационния разтвор във
всяко от четирите кладенчета на стъклата.
5.2.6. Поставете 2 покривни стъкла (24 Ч 24 mm)
на всеки препарат, без да допускате въздух. Поста-
вете препаратите в предварително затоплена влаж-
на камера и хибридизирайте за една нощ в пещ при
55 °C (на тъмно).
5.2.7. Пригответе три стъкленици, съдържащи
1 l ултрачиста вода, 1 l  от 1x хибмикс (334 ml 3x
хибмикс и 666 ml ултрачиста вода) и 1 l от 1/2x
хибмикс (167 ml 3x хибмикс и 833 ml ултрачиста
вода). Предварително инкубирайте всяка на водна
баня при 55 °C.