Държавен вестник, бр. 48, 2006 г., стр. 141

Б Р О Й  48
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
С Т Р .  141
3. Стандартните антигени, използвани в лабо-
раторията, се предават най-малко веднъж годишно
на EИО референтни лаборатории, посочени в т. 2,
за тестване с официалния EИО стандартен серум.
Освен тази стандартизация антигенът в употреба
може да бъде калибриран в съответствие с Б.
4. Реагентите за теста се състоят от:
a) антиген—съдържа специфични гликопротеи-
ни на вируса на ензоотична левкоза по говедата, който
е стандартизиран към официален EИО серум;
б) тестовия серум;
в) известен положителен контролен серум;
г) агар гел: 0,8 % агар; 8,5 % NaCl; 0,05 M Tris-
buffer pH 7,2; 15 ml от агара се поставят в каменно
легенче с диаметър 85 mm, даващ резултат в дъл-
бочина 2,6 mm агар.
5. Тестов образец на 7 свободни от влага клетки
се изрязва в агара до дъното на плаката; образецът
се състои от една централна клетка и 6 клетки в
кръг около нея.
Диаметър на централната клетка—4 mm, диа-
метър на периферни клетки—6 mm.
Разстояние между централни и периферни клет-
ки—3 mm.
6. Централната клетка се напълва със стандар-
тния антиген. Периферните клетки 1 и 4 се напъл-
ват с положителен серум, а клетки 2, 3, 5 и 6—с
тестовите серуми. Клетките се пълнят до изчезва-
не на менискуса.
7. При изследването се използват следните
количества:
антиген—32 µl;
контролен серум—73 µl;
тест серум—73 µl.
8. Инкубирането продължава 72 h при стайна
температура (20 до 27 °C) в затворена влажна
камера.
9. Тестът може да бъде отчетен през 24 и 48 h,
но крайният резултат не може да бъде получен
преди 72 h:
a) тест серум е положителен, ако формира спе-
цифична утаечна линия с BLV антигена и завърше-
на линия на идентификация с контролния серум;
б) тест серум е отрицателен, ако не формира
специфична утаечна линия с BLV антигена и не
изкривява линията на контролния серум;
в) реакцията не може да бъде считана за окон-
чателна, ако тя:
ва) изкривява линията на контролния серум към
BLV антигеновата клетка, без да формира видима
утаечна линия с антигена;
или
вб) ако не може да бъде отчетена или като от-
рицателна или като положителна.
При неокончателни реакции тестовете могат
да бъдат повторени и да бъде използван концент-
риран серум.
10. Всяка друга конфигурация на клетки или
образец може да бъде използван, при условие че
E4 серумът, разреден 1:10 в негативен серум, може
да бъде установен като положителен.
Б. Метод за стандартизация на антиген
Изисквани разтвори и материали
а) 40 ml на 1,6 % агароза в 0,05 M Tris/HCl бу-
фер, pH 7,2 с 8,5 % NaCl;
б) 15 ml от серум на говежда левкоза, който има
антитела само към вирусни гликопротеини на лев-
коза по говедата, разреден 1:10 в 0,05 M Tris/HCl
буфер, pH 7,2 с 8,5 % NaCl;
в) 15 ml на говежда левкоза серум, който има
антитела само към вирусни гликопротеини на лев-
коза по говедата, разреден 1:5 в 0,05 M Tris/HCl
буфериран, pH 7,2 с 8,5 % NaCl;
г) 4 пластмасови легенчета с диаметър 85 mm;
д) перфорация с диаметър от 4 до 6 mm;
е) референтен антиген;
ж) стандартизиран антиген;
з) водна баня (56 °C).
Процедура
Агарозата се разтваря (1,6 %) в Tris/HCl буфер
чрез внимателно нагряване до 100 °C. Поставя се
на 56 °C водна баня за приблизително един час.
Също така се поставят разрежданията на говеж-
дия левкозен серум на 56 °C водна баня.
След това се смесват 15 ml от 56 °C агарозен
разтвор с 15 ml говежди левкозен серум (1:10), бързо
се разклаща и се изсипват 15 ml в едно от двете
каменни легенчета. Процедурата се повтаря с го-
веждия левкозен серум, разреден 1:5.
Когато агарозата се втвърди, в нея се правят
дупки, както следва:
Добавяне на антиген
а) каменни легенчета 1 и 3:
клетка A—с неразреден референтен антиген,
клетка Б—с 1:2 разреден референтен антиген,
клетки В и Д—с референтен антиген,
клетка Г—с неразреден тест антиген;
б) каменни легенчета 2 и 4:
клетка A—с неразреден тест антиген,
клетка Б—с 1:2 разреден тест антиген,
клетка В—с 1:4 разреден тест антиген,
клетка Г—с 1:8 разреден тест антиген.
Допълнителни инструкции
1. Експериментът се изпълнява с две серумни
разреждания (1:5 и 1:10) за получаване на опти-
мална утайка.
2. Ако диаметърът на утайката е прекалено
малък и при двете разреждания, по-нататък серу-
мът трябва да бъде разреден.
3. Ако диаметърът на утайката при двете раз-
реждания е прекалено голям и слаб, се избира по-
нисък серум.
4. Финалната концентрация на агароза трябва
да бъде 0,8 %, този на серумите—съответно 5 и 10 %.
5. Отбелязват се измерените диаметри в след-
ващата координатна система. Разреждането на
антигена се тества със същия диаметър, като ре-
ферентният антиген е работното разреждане.
В. Имуноензимен метод (ЕЛАЙЗА) за откри-
ване на ензоотична левкоза по говедата
1. Материалът и реагентите, които се изпол-
зват, са:
a) твърдофазови микроплаки, епруветки или
друга твърда фаза;
б) антиген—фиксиран към твърдата фаза със или
без помощта на поликлонални или моноклонални
улавящи антитела; ако антигенът е директно прило-
жен към твърдата фаза, всички тестови проби, дава-
щи положителни реакции, се тестват отново към кон-
тролен антиген в случая на EBL. Контролният анти-
ген следва да бъде идентичен с антигена, освен за
BLV антигени; ако улавящите антитела са приложе-
ни към твърдата фаза, антителата не трябва да реа-
гират на антигени, различни от BLV антигени;