Държавен вестник, бр. 31, 2008 г., стр. 29

Б Р О Й  31
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
С Т Р .  29
г) Великото херцогство Люксембург:
д) Италия: Istituto zooprofilattico spenmentale,
Perugia;
е) Нидерландия: Instituut voor Dierhouderij en
Diergezondheid (ID-DLO), Lelystad;
ж) 
Дания: 
Statens 
Veterinaere 
Serum
Laboratorium, Copenhagen;
з) Ирландия: Veterinary Research Laboratory,
Abbotstown, Dublin;
и) Обединеното кралство:
(1) Великобритания: Veterinary Laboratory
Agency, Addlestone, Weybridge, England;
(2) Северна Ирландия: Veterinary Research
Laboratory, Stormont, Belfast;
й) Испания: Subdirreccion general de sanidad
animal. Laboratorio de sanidad y produccion animal
Algete, Madrid;
к) Португалия: Laboratorio Nacional de
Investigacao Veterinaria, Lisbon;
л) Гърция: Кentro Kthniatrikvn Idrumatvn,
Neapolevx 25, 153 10 Aqhna;
м) Австрия: Bundesanstalt fur Tierseuchen-
bekampfung, Modling;
н) Финландия: Elainldakintd-ja elintarvikelaitos,
Helsinki/Anstalten for veterinarmedicin och livsmedel,
Helsingfors;
о) Швеция: Statens veterinarmedicinska anstalt,
Uppsala.
3. Стандартните антигени, използвани в лабо-
раторията, се предават най-малко веднъж годиш-
но на EИО референтни лаборатории, посочени в
т. 2, за тестване с официалния EИО стандартен се-
рум. Освен тази стандартизация антигенът в упо-
треба може да бъде калибриран в съответствие с Б.
4. Реагентите за теста се състоят от:
a) антиген—съдържа специфични гликопро-
теини на вируса на ензоотична левкоза по гове-
дата, който е стандартизиран към официален
EИО серум;
б) тестовия серум;
в) известен положителен контролен серум;
г) агар гел: 0,8 % агар; 8,5 % NaCl; 0,05 M Tris-
buffer pH 7,2; 15 ml от агара се поставят в каменно
легенче с диаметър 85 mm, даващ резултат в дъл-
бочина 2,6 mm агар.
5. Тестов образец на 7 свободни от влага клетки
се изрязва в агара до дъното на плаката; образецът
се състои от една централна клетка и 6 клетки в
кръг около нея.
Диаметър на централната клетка—4 mm, диа-
метър на периферни клетки—6 mm.
Разстояние между централни и периферни клет-
ки—3 mm.
6. Централната клетка се напълва със стандарт-
ния антиген. Периферните клетки 1 и 4 се напъл-
ват с положителен серум, а клетки 2, 3, 5 и 6—с
тестовите серуми. Клетките се пълнят до изчезва-
не на менискуса.
7. При изследването се използват следните
количества:
антиген—32 µl;
контролен серум—73 µl;
тест серум—73 µl.
8. Инкубирането продължава 72 h при стай-
на температура (20 до 27 °C) в затворена влаж-
на камера.
9. Тестът може да бъде отчетен през 24 и 48 h,
но крайният резултат не може да бъде получен
преди 72 h:
a) тест серум е положителен, ако формира
специфична утаечна линия с BLV антигена и за-
вършена линия на идентификация с контрол-
ния серум;
б) тест серум е отрицателен, ако не формира
специфична утаечна линия с BLV антигена и не
изкривява линията на контролния серум;
в) реакцията не може да бъде считана за окон-
чателна, ако тя:
ва) изкривява линията на контролния серум към
BLV антигеновата клетка, без да формира видима
утаечна линия с антигена;
или
вб) ако не може да бъде отчетена или като от-
рицателна, или като положителна.
При неокончателни реакции тестовете могат
да бъдат повторени и да бъде използван концент-
риран серум.
10. Всяка друга конфигурация на клетки или
образец може да бъде използвана, при условие че
E4 серумът, разреден 1:10 в негативен серум, може
да бъде установен като положителен.
Б. Метод за стандартизация на антиген
Изисквани разтвори и материали
а) 40 ml на 1,6 % агароза в 0,05 M Tris/HCl бу-
фер, pH 7,2 с 8,5 % NaCl;
б) 15 ml от серум на говежда левкоза, който има
антитела само към вирусни гликопротеини на лев-
коза по говедата, разреден 1:10 в 0,05 M Tris/HCl
буфер, pH 7,2 с 8,5 % NaCl;
в) 15 ml на говежда левкоза серум, който има
антитела само към вирусни гликопротеини на лев-
коза по говедата, разреден 1:5 в 0,05 M Tris/HCl
буфериран, pH 7,2 с 8,5 % NaCl;
г) 4 пластмасови легенчета с диаметър 85 mm;
д) перфорация с диаметър от 4 до 6 mm;
е) референтен антиген;
ж) стандартизиран антиген;
з) водна баня (56 °C).
Процедура
Агарозата се разтваря (1,6 %) в Tris/HCl буфер
чрез внимателно нагряване до 100 °C. Поставя се
на 56 °C водна баня за приблизително един час.
Също така се поставят разрежданията на говеж-
дия левкозен серум на 56 °C водна баня.
След това се смесват 15 ml от 56 °C агарозен
разтвор с 15 ml говежди левкозен серум (1:10), бързо
се разклаща и се изсипват 15 ml в едно от двете
каменни легенчета. Процедурата се повтаря с го-
веждия левкозен серум, разреден 1:5.
Когато агарозата се втвърди, в нея се правят
дупки, както следва:
Добавяне на антиген:
а) каменни легенчета 1 и 3:
клетка A—с неразреден референтен антиген,
клетка Б—с 1:2 разреден референтен антиген,
клетки В и Д—с референтен антиген,
клетка Г—с неразреден тест антиген;
б) каменни легенчета 2 и 4:
клетка A—с неразреден тест антиген,
клетка Б—с 1:2 разреден тест антиген,
клетка В—с 1:4 разреден тест антиген,
клетка Г—с 1:8 разреден тест антиген.
Допълнителни инструкции
1. Експериментът се изпълнява с две серумни
разреждания (1:5 и 1:10) за получаване на опти-
мална утайка.