Държавен вестник, бр. 109, 2002 г., стр. 58

С Т Р .  58
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  109
на дифузията на авопарцина в среда от агар с
бацилус субтилис. Дифузията се показва чрез
формирането на зони за инхибиране на микро-
организмите. За диаметъра на тези зони се при-
ема, че е в директно съотношение спрямо лога-
ритъма на антибиотичната концентрация, в
рамките на спектъра от използваните антибио-
тични концентрации.
3. Микроорганизъм—бацилус субтилис АТСС
6633 (NCIB 8054)
3.1. Поддържане на щамова култура
Прави се посявка в тръбички, съдържащи
полегати плоскости от културна среда (4.1), с
бацилус субтилис и се оставя да пренощува при
температура 30 °С. Културата се съхранява в
хладилник при температура около 4 °С.
Ежемесечно се правят нови посевки.
3.2. Подготовка на суспензията от спори (1)
Обира се добивът от неотдавна подготвена-
та полегата плоскост от агар (3.1) посредством
2 до 3 ml стерилна вода. Тази суспензия се из-
ползва, за да се направи посявка върху 300 ml от
културната среда (4.1), съдържаща се в колба
на Рукс, и се оставя да престои 3 до 5 дни при
температура 30 °С. Добивът се обира в 15 ml
етанол (4.2), след като се провери под микрос-
коп формирането на малки спори, и се смесва
добре. Тази суспензия може да се запази в
продължение на най-малко 5 месеца при тем-
пература около 4 °С.
4. Културни среди и реагенти
4.1. Културна среда:
Пептон
6,0
Триптофан
4,0
Екстракт от дрожди
3,0
Глюкоза
1,5
Агар
1,0
Вода
1000 ml
pH 6,5 (след стерилизация).
4.2. Етанол 20 % (обем/обем)—200 ml ета-
нол се разреждат с 800 ml вода.
4.3. Солна киселина, отн. т. разреждане 1—
18 до 1—19;
(1) могат да се използват и други методи,
при условие че се установи, че дават аналогич-
ни суспензии от спори;
(2) може да се използва всяка продавана на
пазара среда с аналогичен състав, която дава
същите резултати.
4.4. Натриева основа, разтвор 2 М разтвор.
4.5. Фосфатен буфер, 0,1М—калиев дихид-
роген фосфат, KH2PO4 —13,6 g. Вода до 1000 ml.
Стойността на рН се регулира на 4,5.
4.6. Смес на ацетон/вода/солна киселина
(4.3)—65/32,5/2,5 (v/v/v).
4.7. Стандартна субстанция - авопарцинов
сулфат с позната активност.
5. Стандартни решения
Точно претеглено количество от приблизи-
телно 10 mg от стандартната субстанция (4.7) се
разтваря във фосфатен буфер (4.5) и се разреж-
да с този буфер, така че да се получи основен
разтвор, съдържащ 100 µg авопарцин на 1 ml.
Съхранен в затапена колба при температура 4°С,
този разтвор остава стабилен в продължение
на до 7 дни.
5.1. За предварителни смеси
От този основен разтвор посредством пос-
ледователно разреждане с буфера (4.5) се под-
готвят следните разтвори:
S8                  4 mg/l
S4                  2 mg/l
S2             1 mg/l
S1           0,5mg/l
5.2. За храни за животни
От този основен разтвор посредством пос-
ледователно разреждане с буфера (4.5) се под-
готвят следните разтвори:
S8              2 mg/l
S4                     1 mg/l
S2                 0,5 mg/l
S1                0,25mg/l
6. Подготвяне на ектракта и разтворите за
анализ
6.1. Предварителни смеси
Претегля се възможно най-близко до 10 mg
достатъчно количество проба, която да съдър-
жа 10 до 100 mg авопарцин. Прехвърля се в гра-
дуирана колба от 100 ml с 60 ml от сместа (4.6)
и се разклаща в продължение на 15 min на ме-
ханичен шейкър. Проверява се киселинността
и рН се довежда до стойност 2, ако е необходи-
мо, се използва солна киселина (4.3). Приготвя
се обем със сместа (4.6) и се смесва добре. Една
част се филтрира през подходяща филтърна
хартия (напр. Уотман № 1), като се изхвърлят
първите 5 ml от филтрата. Взима се една алик-
вотна част и рН се регулира до стойност 4,75 с
разтвор на солна киселина (4.4). Този разтвор
се разрежда с буфер (4.5), така че да се получи
очакваната концентрация на авопарцин от 4 µg/
ml (= U8).
От този разтвор се приготвят разтвори U4
(очаквано съдържание: 2 mg/l ), U2 (очаквано
съдържание: 1 mg/l ) и U1  (очаквано съдържа-
ние: 0,5 mg/l ) посредством последователно раз-
реждане (1 + 1) с буфер (4.5).
6.2. Храни за животни
Претеглят се 50 g от пробата и 100 ml от сместа
(4.6) и се разклащат в продължение на 30 min на
механичен шейкър. Екстрактът се избистря
посредством центрофугиране (като се използ-
ват затапени центрофужни тръби), взима се
аликвотна част от избистрения екстракт (виж
таблицата) и се регулира киселинността на рН
4,5 с разтвор на натриев хидроксид (4.4). Тази
аликвотна част се разрежда с буфер (4.5), така
че да се получи U8 (виж таблицата).
От този разтвор се приготвят разтвори U4
(очаквано съдържание: 1mg/l), U2 (очаквано
съдържание: 0,5 mg/l ) и U1  (очаквано съдържа-
ние: 0,25 mg/l), посредством последователно
разреждане (1 + 1) с буфер (4.5).