Държавен вестник, бр. 6, 2006 г., стр. 15

Б Р О Й  6
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
С Т Р .  15
5.2.1.3.1. Антиконски глобулин, маркиран с
пероксидаза, разреден в разтвор, съдържащ PBS +
5 % обезмаслено сухо мляко “Нестле” + 0,05 %
Tween 20 с рН 7,21, се поставя по 100 ml във всяка
ямка, с последвала инкубация 1 час на 37 °С.
5.2.1.3.2. Плаките се промиват, както е описано
в т. 2.
5.2.1.4. Хромоген/субстрат
Във всяка ямка се поставя по 200 ml на ямка
субстратен разтвор (10мл 80,6 mM DMAB
(dimethyl aminobenzaldehyde) + 10 мл fj1,56 mM
MBTH (3-methyl-2-benzo-thiazolinone hydrazone)
+ 5 ml H2 O2). Цветната реакция се спира чрез
прибавяне на 50 ml разтвор на 3N H2 SO4 за около
5—10 мин, преди отрицателната контрола да
започне да се оцветява.
5.2.1.5. Плаките се отчитат на ридър при дъл-
жина на вълната 600 или 620 nm.
5.2.2. Интерпретиране на резултатите
5.2.2.1. Първо се изчислява cut-off стойността,
както следва—С +0,06 (където С е стойността на
отрицателната контрола, 0,6 е стандартното отк-
лонение, получено при група от 30 отрицателни
серума).
5.2.2.2. Пробите, показали стойност, по-ниска
от тази, се смятат за отрицателни.
5.2.2.3. При по-големи стойности от cut-off +
0,15 се считат за положителни.
5.2.2.4. Пробите, показали лъжливо положител-
ни резултати, се подлагат отново на изследване за
потвърждаване на резултатите.
5.3. Блокираща ЕЛАЙЗА за доказване на анти-
тела срещу вируса на АЧК
Чрез метода се доказват специфични антитела
срещу вируса на АЧК в серуми от възприемчиви
към болестта животни. Основен антиген на реак-
цията е VP7 протеинът, който е основен за всички-
те девет серотипа. Този метод се извършва в рефе-
рентната лаборатория по АЧК на Европейската
общност в Алхете, Испания.
5.3.1. ЕЛАЙЗА тест
5.3.1.1. ЕЛАЙЗА плаки
5.3.1.1.1. Плаките се натоварват с новополучен
АЧКВ VP7, разреден в карбонатно-бикарбонатен
буфер с рН 9,6, с последвала инкубация за една
нощ при 4 °С.
5.3.1.1.2. Плаките се промиват петкратно с PBS,
съдържащ 0,05 % v/vTween 20 (PBST).
5.3.1.1.3. Плаката се стабилизира със стабили-
зиращ разтвор, което позволява тя да престоява
продължително време на 4 °С.
5.3.1.2. Контроли със серумни проби
5.3.1.2.1. Скрининг тест серумите и контролите
се разреждат в PBST1:10 директно върху плаката
до получаване на краен обем 100 µl на ямка, с пос-
ледвала инкубация от 1 час при 37 °С.
5.3.1.2.2. Титрация: приготвя се двойна серия
разреждане на тестираните серуми и положител-
ните контроли (100 ml на ямка от 1:10 до 1:280).
Отрицателните контроли се разреждат 1:10.
5.3.1.3. Конюгат
Добавя се по 50 µl на ямка предварително раз-
реден моноклонално антитяло срещу VP7, марки-
рано с пероксидаза, като след хомогенизиране и
разбъркване престоява 30 мин при 37 °С.
5.3.1.4. Плаките се промиват петкратно с PBST
и се подсушават.
5.3.1.5. Хромоген/субстрат
Прибавят се по 100 µl на ямка хромоген/суб-
стратен разтвор (1 мл ABTS(2,2'-Azino-bis-[3-
етилбензотиазолин-6-sulphuric acid]) 5 mg/ml +
9 ml субстратен разтвор (0,1 M фосфатно-цитра-
тен буфер с рН 4, съдържащ 0,03 % H2 O2) и се
инкубира в продължение на 10 мин на стайна
температура. Оцветяването се спира чрез приба-
вяне на 100 µl на ямка 2 % (w/v) SDS (sodium
dodecyl sulphate).
5.3.1.6. Отчитане
Извършва се посредством ЕЛАЙЗА ридър при
дължина на вълната 405 nm.
5.3.2. Интерпретиране на резултатите.
5.3.2.1. Валидност на теста
Той е валиден, когато оптичната плътност на
отрицателната контрола(ОК) е по-висока от 1,0,
а тази на положителната контрола (ПК) е по-
ниска от 0,2.
5.3.2.2. Изчисляване на пределните стойности:
положителна стойност (ПК)—ОК—(ОК—
ПК) Ч 0,3;
отрицателна стойност (ОК)—ОК—(ОК—ПК) Ч
0,2,
където ОК е екстинцията на отр. контрола, а
ПК—на положителната.
5.3.2.3. Интерпретиране на резултатите
Проби с екстинция, по-ниска от положителна-
та стойност, се считат за положителни за антите-
ла срещу АЧКВ.
Проби с екстинция, по-висока от отрицателна-
та стойност, се считат за отрицателни за антитела
срещу АЧКВ.
Проби с екстинция между тези две стойности се
считат за съмнителни, като две до три седмици след
това се вземат нови кръвни проби от същите жи-
вотни и се подлагат отново на изследване с теста.
5.4. Имуноблотинг тест
Свързването на антитела с вирусни протеини,
разделени при електрофореза и след това прехвър-
лени върху нитроцелулозна мембрана, също се
прилага като метод за доказване на антитела сре-
щу вируса на АЧК.
5.4.1. Тест процедура
Полупречистените протеини от вируса на АЧК
се разделят с помощта на SDS-PAGE (sodium
dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis)