Държавен вестник, бр. 28, 2007 г., стр. 41

Б Р О Й  28
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
С Т Р .  41
(е) Оцветената натривка се разглежда със свет-
линен микроскоп под имерсия и увеличение 1000х,
като се използва маслено-имерсионен обектив.
(ж) Гранулите РНВ, налични в клетките на
Ralstonia solanacearum, се оцветяват в синьо-чер-
но. Клетъчната стена се оцветява в розово.
3. Тест Сероаглутинация
Аглутинацията на клетки на R. solanacearum
в бактериален ексудат или симптоматични тъ-
канни екстракти се наблюдава най-добре, като
се използват валидирани антитела (виж Допъл-
нение 3), етикетирани с маркери с подходящ цвят,
например червено за клетки на Staphylococcus
aureus или цветни латексови частици. Когато се
използва кит, закупен в търговската мрежа (виж
Допълнение 3), се спазват указанията на произ-
водителя. В противен случай се извършва след-
ната процедура:
а) Смесват се капки от суспензия на етикети-
рано антитяло и бактериален ексудат или суспен-
зия (приблизително 5 µl от всяко) в кладенчета
на стъкла за IF.
б) Приготвят се положителни и отрицателни
контроли, като се използва суспензия на R.
solanacearum биовар 2 и несъответстващ щам.
в) Наблюдава се за аглутинация в положител-
ни проби след внимателно разбъркване за 15 се-
кунди.
4. Изолация върху селективни среди
4.1. Посявка в петрита
Забележка. Преди да се използва този метод за
пръв път, се извършват предварителни тестове, за
да се гарантира възпроизводимо установяване на
103 до 104 клетки, образуващи колонии на R.
solanacearum, на ml, добавени към екстракти от
проби, които са дали отрицателен резултат при
предишно тестване.
Използва се съответстващо утвърдена селек-
тивна среда, като например SMSA (модифицирана
от Elphinstone et al., 1996 г.; виж Допълнение 2).
Изисква се внимание, за да се разграничи R.
solanacearum от други бактерии, които могат да
развият колонии върху средата. Освен това коло-
ниите от R. solanacearum могат да покажат атипич-
на морфология, ако в петритата присъстват и бак-
терии антагонисти. Когато има съмнение за пос-
ледствия от антагонизъм, пробата следва да се тества
повторно, като се използва друг различен тест.
Най-висока чувствителност на установяване
чрез този метод може да се очаква, когато се из-
ползват прясно приготвени екстракти от проби.
Но методът е приложим и при използването на
екстракти, които са били съхранявани в глицерин
при температура от -68 до -86 °С.
За положителни контроли се приготвят десе-
тократни разреждания от суспензия на 106 клетки
на ml от вирулентен щам, биовар 2 на R.
solanacearum (например NCPPB 4156 = PD 2762 =
= CFBP 3857). За да се избегне всяка възможност
за заразяване, положителните контроли се пригот-
вят отделно от пробите за тестване.
За всяка приготвена партида селективна среда
задължително се изпитва нейната пригодност за
растеж на патогена, преди да се използва за тест-
ване на проби.
Контролният материал се изпитва по същия
начин както пробата/пробите.
4.1.1. Изпълнява се подходяща техника за по-
сявка върху петри, като целта е да се отстранят,
чрез разреждането фона на сапрофитните попула-
ции. Разпределят се 50—100 µl за петри от екст-
ракта на пробата и всяко разреждане.
4.1.2. Петритата се инкубират при 28 °С. Отчи-
тането на петритата става след 48 часа, а след това
ежедневно до 6 дни. Типичните R. solanacearum
колонии върху SMSA среда са млечнобели, плос-
ки, с неправилна форма, течни и след тридневна
инкубация развиват розово до кървавочервено
оцветяване в центъра с вътрешно набраздяване
(виж интернет страница http://forum.europa.eu.int/
Public/irc/sanco/Home/main).
Забележка. Върху тази среда понякога се обра-
зуват атипични колонии. Те може да са малки,
кръгли, само червени на цвят и нефлуидни или само
отчасти флуидни и затова трудно се различават от
колониите на сапрофитните бактерии.
4.1.3. Вероятните колонии на R. solanacearum след
посявка, като щрих или разреждане в петри, се пре-
чистват върху обща хранителна среда, за да се полу-
чат единични колонии (виж Допълнение 2).
4.1.4. Културите се съхраняват краткосрочно в
стерилна вода (pH от 6 до 8, без съдържание на
хлор) при стайна температура на тъмно или дъл-
госрочно в подходяща криозащитна среда при -68
до -86 °С или лиофилизирани.
4.1.5. Определят се вероятните култури (виж
раздел VI.Б) и се извършва тест за патогенност
(виж раздел VI.В).
Интерпретиране на резултатите от посявката в
петри
Тестът е отрицателен, ако не се наблюдават
никакви бактериални колонии след шест дни или
ако не са открити никакви типични колонии за R.
solanacearum, при условие че не се очаква вероят-
но инхибиране от други бактерии, и са намерени
типични за R. solanacearum колонии в петритата с
положителните контроли.
Тестът е положителен, ако са изолирани ти-
пични за R. solanacearum колонии.
4.2. Процедура на обогатяване
Използва се утвърдена среда за обогатяване,
като например видоизменена хранителна среда на
Wilbrink broth (виж Допълнение 2).
Тази процедура може да се използва за селек-
тивно увеличаване на популациите на R.
solanacearum в екстрактите от проби и за увели-
чаване на чувствителността на откриване. Про-
цедурата също така ефективно разрежда инхиби-
торите на PCR реакцията (1:100). Но следва да се
обърне внимание, че обогатяването на R.
solanacearum може да се провали поради антаго-
низма на сапрофитни организми, които често се
обогатяват едновременно. Поради тази причина
изолирането на R. solanacearum от обогатени хра-
нителни култури може да се затрудни. Освен това,
тъй като популациите на серологично свързани
сапрофити могат да се увеличат, се препоръчва
използването на специфични моноклонални ан-
титела пред поликлоналните антитела, когато ще
се използва ELISA тест.