Държавен вестник, бр. 6, 2006 г., стр. 12

С Т Р .  12
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  6
1. Клетъчни култури
За изолиране на вируса на АЧК успешно се
използват постоянна клетъчна линия от бъбрек на
хамстер (BHK 21) и постоянна клетъчна линия от
миши бъбрек (VERO). Кръвните проби с хепарин
се използват за инокулиране неразредени, като след
60 мин адсорбция клетките се промиват и се доба-
вя поддържаща среда. При заразяването на кле-
тъчните линии с органни суспензии от далак, бял
дроб и лимфен възел те трябва да бъдат 10 %-ни
(обем/обем), приготвени с фосфатен буфер (PBS)
или клетъчно културална среда, съдържаща анти-
биотици. При наличие на вирус се появява цитопа-
тичен ефект на клетъчни култури (ЦПЕ) от два до
осем дни след заразяването. Задължително се из-
вършват три слепи пасажа преди поставянето на
отрицателна диагноза.
2. Новородени мишлета
За изолиране на вируса се използва и интраце-
ребрално заразяване на 1—3-дневни новородени
мишлета най-малко от две семейства. При поло-
жителна реакция при животните се установяват
нервни признаци между 3-тия и 15-ия ден след
инокулацията. Мозъкът от всичките мишлета (по
семейства) се събира, хомогенизира и инокулира
повторно на нови най-малко шест новородени
мишлета. При този втори пасаж нервните призна-
ци трябва да се появят по-рано (от 2-рия до 5-ия
ден) при 100 % заразяемост.
3. Сандвич ЕЛАЙЗА
Най-малко две реакции ЕЛАЙЗА са разрабо-
тени за доказване на вирусен антиген от теренни
проби или лабораторно заразени клетъчни кул-
тури. Едната техника използва поликлонални ан-
титела (ПКА), а другата—моноклонални (МКА),
на един и същ основен протеин, който е общ за
повечето серотипове на заболяването—VP7.
Двата метода могат да се прилагат независимо
един от друг, като чрез тях бързо (от 2 до 4 часа)
се поставя диагноза АЧК. Реагентите за тези
реакции се получават в случай на нужда от Рефе-
рентната лаборатория за АЧК в Европейския
съюз.
3.1. Извършване на ЕЛАЙЗА теста при изпол-
зването на моноклонално антитяло
3.1.1. Твърда фаза—плаките се натоварват със
смес от МКА 5G5 и 3D2, разтворени в PBS съот-
ветно 10 ml/ml всяко с последвала инкубация една
нощ на 4 °С.
3.1.2. След трикратно промиване на плаките с
дестилирана вода, съдържаща 0,05 % Tween 20, те
внимателно се изтръскват върху адсорбиращ ма-
териал до отстраняване на излишната течност в
ямките.
3.1.3. Накапва се по 200 ml на ямка блокиращ
разтвор, съдържащ PBS + 1 % говежди серумен
албумин (БСА), за един час на 37 °С.
3.1.4. Изсипва се внимателно блокиращият раз-
твор и се изтръскват плаките.
3.1.5. Пробите за изследване (далачни суспен-
зии или клетъчнокултурална течност) се накап-
ват в неразредено състояние, последвано от две
разреждания в PBS+1 % БСА по 100 ml на ямка, с
последвала инкубация от 1 час на 37 °С. Суспензи-
ята от органи (далак, бял дроб, л. възел) се получа-
ва, като 2 см (около 1 г) от органа се хомогенизи-
рат в 3 мл MEM (Minimal essential medium) среда,
с последвало центрофугиране на 600 g за 10 мин,
като се използва супернатантът.
3.1.6. Плаките се промиват трикратно.
3.1.7. Във всяка ямка се накапва конюгат—по
100 ml биотин-макрирано5G5 МКА, в разреждане
1:500 в PBS+1 % БСА. След инкубиране за един
час на 37 °С плаките се промиват и се накапва по
100 ml на ямка авидин-пероксидаза в оптимално
разреждане в PBS+1 % БСА, с последвал престой
45 мин на стайна температура.
3.1.8. Плаките се промиват трикратно и в тях се
накапва по 200 ml на ямка субстратен разтвор 10 мл
80,6 mM DMAB (dimethyl aminobenzaldehyde) + 10
мл fj1,56 mM MBTH (3-methyl-2-benzo-thiazolinone
hydrazone) + 5 ml H2O2. Цветната реакция се спира
чрез прибавяне на 50 ml разтвор на 3N H2 SO4 за
около 5—10 мин, преди отрицателната контрола
да започне да се оцветява.
3.1.9. Плаките се отчитат на ридър при 600 или
620 nm.
3.2. Интерпретиране на резултатите
3.2.1. Първо се изчислява пределната стойност,
както следва—С + 0,06 (където С е стойността на
отрицателната контрола, 0,6 е стандартното отк-
лонение, получено при група от 30 отрицателни
серума).
3.2.2. Пробите, показали стойност, по-ниска от
тази, се смятат за отрицателни.
3.2.3. При по-големи стойности от пределната
стойност + 0,15 се считат за положителни.
3.2.4. Пробите, показали лъжливо положител-
ни резултати, се подлагат отново на изследване за
потвърждаване на резултатите.
4. Полимеразно верижна реакция
PCR тестът е специфичен за доказване на ви-
русния РНК на АЧК. Праймерите кореспондират
с 5' края (нуклеотиди 1—21) и в 3' края (нуклеоти-
ди 1160—1179) от сегмент 8 от РНК на вируса.
Извършване на теста
От далачна суспензия се екстрахира нуклеи-
новата киселина, както следва: 1 г от пробата се
хомогенизира в 1 мл от денатуриращ разтвор (4 М
guanidium thiocyanate, 25 mM sodium citrate, 0,1 M
2-mercaptoethanol, 0,5 % sarcosyl), след което се
извършва центрофугиране. Към супернатанта се
прибавят 1 g чиста РНК, 0,1 ml of 2 M sodium acetate
pH4, 1 ml phenol and 0,2 ml chloroform/isoamyl
alcohol mixture (49/1), като получената смес вни-
мателно се разбърква в продължение на 15 мин в
баня от лед. Следва отделяне на преципитирана-
та РНК на вируса след фенолна екстракция и пре-
ципитация с алкохол. Методът на ДНК синте-
зата и PCR амплификацията се прилага при 37 °C.
Секвенциите на PCR праймерите използват пос-
ледователност 5' GTTAAAATTCGGTTAGGATG 3',
която винаги кореспондира с поляритета на до-
бавената РНК. Анализът на получения резултат
чрез PCR се извършва посредством електрофо-
реза с 1,2 % агаразен гел, съдържащ ethidium
bromide.