Държавен вестник, бр. 23, 2010 г., стр. 73

БРОЙ  23	
Д Ъ Р Ж А В Е Н  В Е С Т Н И К 	
СТР.  73  
2.5.1. Антигенът представлява бактериална 
суспензия в разтвор от буфериран бруцелозен ан­
тиген при pH от 3,65 ± 0,05, оцветена с боя роз 
бенгал. Антигенът се доставя готов за използване 
и трябва да се съхранява при 4 °C и да не бъде 
замразяван.
2.5.2. Антигенът се приготвя, без да се посочва 
клетъчната концентрация, но неговата чувстви­
телност трябва да бъде стандартизирана по отно­
шение на OIEISS по такъв начин, че антигенът 
да произведе положителна реакция при разтвор 
на серума от 1/45 и отрицателна реакция при 
разтвор от 1/55.
2.5.3. RBT се изпълнява по следния начин:
а) серумът (20 – 30 μl) се смесва с равен обем 
антиген върху бяла плочка или плочка от емайл, 
така че да се получи зона от около 2 cm в диа­
метър. Сместа се разклаща леко в продължение 
на четири минути на стайна температура и после 
се наблюдава под добро осветление за наличие 
на аглутинация;
б) ако се използва автоматизиран метод, той 
трябва да бъде поне толкова чувствителен и пре­
цизен, колкото ръчния метод.
2.5.4. Интерпретиране на резултатите
Всяка видима реакция се смята за положителна, 
освен ако по ръбовете се наблюдава прекомерно 
засъхване.
Във всяка серия тестове трябва да бъдат включе­
ни положителни и отрицателни работни стандарти.
2.6. Изследване чрез серумна реакция аглути­
нация (SAT)
2.6.1. Антигенът представлява бактериална 
суспензия във фенолизиран физиологичен разтвор 
(NaCl 0,85 % (m/v) и фенол 0,5 % (v/v). Не трябва 
да се използва формалдехид. Антигените могат 
да се доставят в концентрирано състояние, при 
условие че факторът, който трябва да се използва 
за разтвора, е посочен на етикета на ампулата. 
Към суспензията от антиген може да се добави 
етилендиаминтетраацетат (ЕДТА) до получаването 
на окончателен тестов разтвор от 5 mM, за да се 
намали нивото на фалшиви положителни реакции 
при серумаглутинационния тест. Впоследствие 
pH от 7,2 трябва да се коригира в суспензията 
от антиген.
2.6.2. OIEISS съдържа 1000 международни 
единици аглутинация.
2.6.3. Антигенът се приготвя, без да се посочва 
клетъчната концентрация, но неговата чувстви­
телност трябва да бъде стандартизирана по отно­
шение на OIEISS по такъв начин, че антигенът 
да произведе 50 % аглутинация при окончателен 
разтвор на серума между 1/600 и 1/1000 или 75 % 
аглутинация при окончателен разтвор на серума 
между 1/500 и 1/750.
Също така може да бъде полезно да се сравни 
реактивността на нови и стандартизирани преди 
това партиди от антигени, като се използва набор 
от дефинирани серуми.
2.6.4. Тестът се провежда в епруветки или в 
микроплаки. Сместа от антиген и разтвори от 
серуми се инкубира при 37 °C за 16 – 24 часа.
Приготвят се най-малко три разтвора за всеки 
серум. Разтворите на съмнителен серум трябва 
да бъдат правени по такъв начин, че отчитането 
на реакцията в границата на положителност да 
се прави в средната епруветка (или в средната 
клетка при метода на микроплаките).
2.6.5. Интерпретиране на резултатите
Степента на бруцелозна аглутинация в серум 
трябва да бъде изразена в международни единици 
аглутинация (IU) на милилитър. Серум, съдържащ 
30 или повече IU на ml, се счита за положителен.
2.7. Флуоресцентно-поляризационен тест (FPA)
2.7.1. FPA може да бъде проведен в стъклени 
епруветки или в микроплаки с 96 клетки. Използ­
ваните техники, тяхната стандартизация и интер­
претирането на резултатите трябва да отговарят 
на определеното в Наръчника по диагностични 
тестове и ваксини за сухоземни животни на OIE, 
шесто издание, 2008 г., глава 2.4.3 (бруцелоза по 
говедата).
2.7.2. Стандартизация на теста
FPA се стандартизира така, че:
а) OIEELISASPSS и OIEELISAWPSS да дават 
систематично положителни резултати;
б) предварителният разтвор от 1/8 от 
OIEELISAWPSS или предварителният разтвор от 
1/64 от OIEELISASPSS, реализиран в отрицателен 
серум (или в смес от отрицателни серуми), да 
води винаги до отрицателна реакция;
в) OIEELISANSS да води винаги до отрицателна 
реакция. Във всяка партида тестове трябва да бъдат 
включени: силноположителен, слабоположителен, 
отрицателен серум работен стандарт (калибрирани 
спрямо стандартните серуми ЕЛАЙЗА на OIE).
3. ДОПЪЛНИТЕЛНИ ТЕСТОВЕ
3.1. Кожен тест за бруцелоза (BST)
3.1.1. Условия за използването на BST 
a) Кожният тест за бруцелоза не се използва за 
целите на сертифицирането за търговия в рамките 
на Общността.
б) Кожният тест за бруцелоза е един от най-
специфичните тестове за откриване на бруцелоза 
при неваксинирани животни; при все това не 
бива да се прави диагноза въз основа само на 
положителни интрадермални реакции.
в) Говеда, тествани с отрицателен резултат 
при един от серологичните тестове, определени 
в това приложение и реагиращи положително на 
BST, се считат за инфектирани или със съмнение 
за инфекция. 
г) Говеда, тествани с положителен резултат при 
един от серологичните тестове, определени в това 
приложение, могат да бъдат подложени на BST, за 
да се потвърди интерпретирането на резултатите от 
серологичните тестове, особено в случаите, когато 
не може да се изключи кръстосана реакция между 
антитела и други бактерии в официално свободно 
или в свободно от бруцелоза стадо говеда.
3.1.2. Тестът трябва да се проведе, като се из­
ползва стандартизиран и дефиниран бруцелозен 
алергенен препарат, който не съдържа антиген 
на гладки липополизахариди (LPS), тъй като това 
може да предизвика неспецифични възпалителни 
реакции или да повлияе на по-нататъшните се­
рологични тестове.
Изискванията за производство на бруцелин 
трябва да съответстват на посочените в глава 2.4.3, 
раздел С, точка 1 от Наръчника по диагностични 
тестове и ваксини за сухоземни животни на OIE, 
шесто издание, 2008 г.
3.1.3. Процедура на теста
3.1.3.1. 0,1 ml бруцелозен алерген се инжектира 
интрадермално в опашната гънка, в кожата на 
хълбока или в една от страните на шията.
3.1.3.2. Тестът се отчита след 48 – 72 часа.