Държавен вестник, бр. 28, 2007 г., стр. 38

С Т Р .  38
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  28
(1) Препоръчителните процедури за пробовзе-
мане са дадени в раздел IV.2.1.
(2) Описание на методите за концентрация на
патогена е дадено в раздел IV.2.1. Концентрацията
увеличава популациите както на патогена, така и
на конкурентните сапрофитни бактерии и се пре-
поръчва само ако не води до инхибиране на изола-
ционния тест.
(3) Описание на теста за селективна изолация е
дадено в раздел VI.А.4.
(4) Описание на теста на биологична проба е
дадено в раздел VI.А.9.
(5) Описание на PCR методи за обогатяване е
дадено в раздел VI.А.4.2 и раздел VI.А.6.
(6) Описание на ЕLISA методи за обогатяване
е дадено в раздел VI.А.4.2 и VI.А.8.
(7) Описание на типична морфология на коло-
ния е дадено в раздел II.3.г.
(8) Култивирането може да не е успешно пора-
ди конкуриране или инхибиране от сапрофитни
бактерии. Ако има вероятност големият брой сап-
рофитни популации да се отразят неблагоприятно
на надеждността на изолацията, тестът за изола-
ция се повтаря след разреждане на пробата в сте-
рилна вода.
(9) Надеждно идентифициране на чисти пред-
полагаеми култури на R. solanacearum се постига,
като се използват тестовете, описани в раздел VI.Б.
(10) Описание на теста за патогенност е дадено
в раздел VI.В.
2. Методи за установяване и идентифициране
на R. solanacearum във вода
Принцип
Валидираната схема за установяване наличи-
ето на бактерията, описана в настоящия раздел,
се прилага за установяване на патоген в проби от
повърхностна вода и може също да се прилага за
изпитване на проби от води от преработка на кар-
тофи или отпадни води. Важно е, обаче, да се
отбележи, че очакваната чувствителност на ус-
тановяването на наличие се променя в зависи-
мост от субстрата. Чувствителността на теста за
изолация се влияе от популациите конкурентни
сапрофитни бактерии, които по принцип са мно-
го повече във водите от преработка на картофи
и в отпадъчните води, отколкото в повърхност-
ните води. Въпреки че от схемата, дадена по-долу,
се очаква да установи не по-малко от 103 клетки
на литър в повърхностни води, чувствителност-
та на установяването на наличие във водите от
преработка на картофи и в отпадните води е зна-
чително по-ниска. Поради тази причина се пре-
поръчва изпитването на отпадни води да става
след всяко третиране за пречистване (напр. ута-
яване или филтриране), при което се редуцират
популациите на сапрофитни бактерии. Ограни-
ченията в чувствителността на схемата за изпит-
ване трябва да се имат предвид, когато се оценя-
ва надеждността на получени отрицателни ре-
зултати. Въпреки че схемата се използва успеш-
но при наблюдения за определяне на наличие или
отсъствие на патогена в повърхностни води, ней-
ните ограничения трябва да се имат предвид,
когато схемата се използва в подобни наблюде-
ния на води от преработка на картофи или от-
падни води.
2.1. Подготовка на пробата
Забележка:
—Установяването на R. solanacearum в повърх-
ностни води е най-надеждно през късна пролет,
лятото и есента, когато температурата на водата
надвишава 15 °С.
—Многократното пробовземане по различно
време през периода, упоменат по-горе, на опреде-
лени места за пробовземане увеличава надеждност-
та на установяването, като намалява влиянието на
промените в климата.
—Необходимо е да се вземе предвид въздейст-
вието на силните валежи и географията на реките,
за да се избегнат последствията от продължител-
но разреждане, които могат да замъглят наличие-
то на патогена.
—Пробите от повърхностни води се вземат в
близост до растенията гостоприемници, ако има
такива.
2.1.1. На избраните за пробовземане места се
събират проби чрез напълване на стерилни епру-
ветки или бутилки на дълбочина по възможност
под 30 cm и до 2 m от брега. За водите от прера-
ботка и отпадните води пробите се събират на
мястото на изхвърляне. Препоръчва се размерът
на пробите за едно място на пробовземане да бъде
до 500 ml. Ако се предпочитат по-малки проби,
се препоръчва пробовземането да стане поне на
три пъти за всяко място на пробовземане, като
всяка проба е съставена от две еднакви подпро-
би по 30 ml най-малко. При интензивни наблю-
дения се избират поне три места на пробовзема-
не през 3 km по речното течение, като се осигу-
рява пробовземане и от притоците, които се вли-
ват в реката.
2.1.2. Пробите се транспортират на хладно и тъм-
но (4 до 10 °С) и се изпитват в рамките на 24 часа.
2.1.3. При необходимост бактериалната фрак-
ция може да бъде концентрирана, като се използва
един от следните методи:
а) 30 до 50 ml подпроби се центрофугират при
10 000 g за 10 минути (или 7000 g за 15 минути) за
предпочитане при температури от 4 до 10 °С, от-
странява се надутайката и повторно се суспендира
утайката в 1 ml буфер за разтваряне на утайката
(допълнение 4).
б) Мембранна филтрация (минимален размер
на порите 0,45 µm), последвана от измиване на фил-
търа в 5 до 10 ml буфер за разтваряне на утайката
и запазване на отмитото. Този метод е подходящ
за големи количества вода, съдържащи малък брой
сапрофити.
Концентрирането обикновено не се препоръч-
ва за проби от преработка и отпадните води, тъй
като увеличените популации на конкурентните
сапрофитни бактерии ще инхибират установява-
нето на Ralstonia solanacearum.
2.2. Изпитване
Виж схемата и описанието на тестовете в съот-
ветните допълнения.