Държавен вестник, бр. 5, 2006 г., стр. 24

С Т Р .  24
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  5
2.6. “чиста” стая за подготовка на клетъчни
култури, среди и посуда;
2.7. лаборатория за серологични изследвания с
използване на инактивиран антиген;
2.8. помещение за персонала.
3. Лабораторно облекло
При работа с биологичен материал, трупове,
диагностични проби от терена, кръв и опитно за-
разяване на лабораторни животни се използват:
работно облекло за еднократна употреба, покри-
ващо плътно всички части на тялото, ръкавици,
шапки, очила и маски. Работното облекло, стък-
ларията и инвентарът подлежат на унищожаване
след приключване на манипулациите.
При работа с инактивиран антиген се допуска
използването само в серологичната лаборатория на
работно облекло, което се пере, суши и глади в лабо-
раторията. Стерилизацията на стъкларията и инвен-
тара се извършва също само в лабораторията.
4. Контрол на персонала
В лабораторията за диагностика на АЧС се
допускат през мокър филтър поименно само лица
от персонала, придобили съответната квалифика-
ция и инструктирани срещу подпис за работа с
особено опасен вирус.
На персонала не се разрешава да има достъп до
прасета 48 часа след напускане на лабораторията.
5. Оборудване
5.1. ламинарен бокс (клас III) с двойна НЕРА
филтрация;
5.2. фризер (минус 70 °С);
5.3. фризер (минус 20 °С);
5.4. хладилници (минус 4 °С);
5.5. тъканен хомогенизатор;
5.6. инкубатор;
5.7. криостатен микротом;
5.8. флуоресцентен микроскоп;
5.9. светлинен микроскоп;
5.10. охлаждаща центрофуга;
5.11. ултрацентрофуга;
5.12. бидестилатор;
5.13. двупроходен автоклав;
5.14. перална машина със сушилня и ютия;
5.15. общо лабораторно оборудване: везни, рН
метър, миксер, водна баня, многоканални и едно-
канални пипети с обем от 10 до 1000 ml и съответ-
ни еднократни наконечници, еднократна посуда
за рутинни вирусологични изследвания и поддър-
жане на клетъчни култури, хранителни среди и
реактиви;
5.16. ELISA система: инкубатор, миещо устрой-
ство, рийдер за спектрофотометрично отчитане на
плаки, компютър със съответен софтуер и принтер;
5.17. PCR оборудване.
6. Вирусни щамове
Всички изолати на вируса на АЧС се съхраня-
ват дълбоко замразени в заключен фризер, който
не се използва за съхраняване на други вируси и
материали, несвързани с диагностиката на АЧС.
Използват се индивидуални ампули, щателно но-
мерирани, с етикет. Води се стриктна конфиден-
циална документация за вирусните щамове: про-
изход, дати и резултати от контролните изследва-
ния в лабораторията, както и резултатите от гене-
тичното типизиране на Референтната лаборатория
на Европейския съюз.
7. Опитни животни
Използването на опитни животни не се препо-
ръчва. В случай на крайна необходимост с изрично-
то писмено разрешение на генералния директор на
НВМС се допуска провеждането на биологичен опит
в биообезопасено звено в рамките на лаборатория-
та за АЧС при строги мерки за сигурност, денонощ-
на охрана и с участието само на персонала на лабо-
раторията. Всички опитни животни се унищожават
в рамките на звеното след приключване на опита,
труповете се обезвреждат и изгарят.
III. Диагностични методи
1. Доказване на вируса
1.1. Проби и подготовка на пробите за из-
следване.
При подозрение за АЧС в референтната за стра-
ната лаборатория се изпращат следните проби: кръв
в антикоагулант (хепарин или етилен диамин тет-
раоцетна киселина—EDTA), далак, тонзили, бъб-
реци, лимфни възли. Пробите по време на транс-
порта се съхраняват колкото се може по-добре
охладени, без да се замразяват.
За провеждане на реакция хемадсорбция и ино-
кулация на прасета от тъканите се изготвя суспен-
зия чрез нарязване на малки парченца и стриване
в хаван или с помощта на тъканен хомогенизатор.
След това се добавя 5—10 ml буфериран солеви
разтвор или среда за клетъчни култури, съдържа-
щи антибиотици. Суспензиите се пречистват чрез
центрофугиране при 1000 g за 5 min. За постановка
на реакция хемадсорбция и за инокулация на пра-
сета се използва супернатантата.
1.2. Реакция хемадсорбция (HT).
Тестът е основен и определящ за АЧС поради
факта, че свинските еритроцити адхезират по повър-
хността на свински моноцити или макрофаги, зара-
зени с вируса на АЧС, като повечето изолати на този
вирус предизвикват феномена хемадсорбция. Изо-
лирани са много малко нехемадсорбиращи вируси,
повечето от които са авирулентни, но някои могат
да причинят типична акутна форма на болестта.
Реакцията се провежда чрез заразяване на пър-
вични левкоцитни култури с кръв или тъканни сус-
пензии от съмнително болни прасета (процедура
1) или чрез изготвяне на левкоцитни култури от
кръв на заразени в лабораторията прасета или
такава от съмнително болни прасета на терена
(процедура 2). От 100 ml събрана дефибринирана
или хепаринизирана кръв могат да се приготвят до
300 култури. Основно правило е всички процедури
да се извършат по начин, предпазващ от контами-
ниране на културите.
Процедура 1. HT в първични левкоцитни
култури
Прясна кръв от прасе се обработва с хепарин
(100 IU/ml кръв), центрофугира се при 700 g за
30 min, левкоцитите се изваждат, промиват се със
среда, ресуспендират се до концентрация от 10 на
7 степен клетки/ml в среда за клетъчни култури,
съдържаща 10—30 % свински серум и антибиоти-
ци. За избягване на неспецифична хемадсорбция
средата трябва да съдържа серум или плазма от
същото прасе, от което са добити левкоцитите.
Клетъчната суспензия се разлива в епруветки
160 Ч 16 mm в равно количество от 1,5 ml, които се
инкубират в положение 5—10 °С към хоризонтала-
та при 37 °С. Достатъчно чувствителни към вируса
за рутинна диагностика са културите на възраст от
2 до 4 дни.