Държавен вестник, бр. 82, 2002 г., стр. 15

Б Р О Й  82
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
С Т Р .  15
В. Включване.
Декалцинираната кост се включва в първи парафин
за 3 часа и във втори парафин—за 1 час и 30 мин. Следва
рутинната обработка за всички видове тъкани.
5. Стандартна биопсична процедура за трепано-
биопсии
Преди фиксиране на материала се правят цитоло-
гични отпечатъци, които се оцветяват по Папенхайм.
5.1. Фиксация в буфериран формалин—24 часа.
5.2. Декалцинация, без предварително промиване—
2—3 часа под контрол.
5.3. Промиване с вода—30 минути.
5.4. 70-градусов спирт—1 час.
5.5. 96-градусов спирт—18 часа (до другия ден).
5.6. 96-градусов спирт—4 часа.
5.7. Ацетон:
—при размер на материала до 1 см—2—15 мин.;
—при размер на материала от 1 до 3 см—2 по 20 мин.
5.8. Парафин—18 часа (до другата сутрин) на 58 гра-
дуса в термостат;
5.9. Заливане с парафин. Материалът се ориентира,
така че дългата му страна да е успоредна на ножа.
6. Процедура на хистохимичното изследване
6.1. Същност. Хистохимичното изследване цели да се
определи тъканната и клетъчната локализация на опре-
делени химични съединения, чрез което се разкриват най-
пълно фините структурно-функционални взаимоотноше-
ния в организма. С хистохимични методи в патологията
се определят съдържанието и локализацията на химични
вещества в клетките и извънклетъчните структури при
различни патологични процеси в организма.
6.2. Област на приложение. Хистохимичните мето-
ди на изследване широко се прилагат в диагностичната
практика на патолозите, тъй като допълват и задълбо-
чават морфологичната информация, получена чрез ру-
тинната хистология, и дават възможност да се свържат
микроскопските образи с нарушенията в обменните
процеси на клетките и извънклетъчните структури.
Особено голямо е приложението им при диагностиката
на туморни процеси , а също така и при диагностицира-
нето на генетично обусловени болести, системните за-
болявания на съединителната тъкан и др.
6.3. Методичен принцип. Основните изисквания за
правилното провеждане на хистохимичните методики са:
• максимално бързо вземане на материала;
• достатъчен по количество и размери материал;
• добра и правилна фиксация според целите на хис-
тохимичното изследване.
Хистохимичните методики се основават на принци-
па на директното оцветяване в тъканите на търсените
химични вещества (или групи от вещества), които про-
явяват афинитет към определени оцветители. Може да
се осъществи и визуализация на образуваните при раз-
лични химични реакции неразтворими хромогени, нат-
рупващи се в места, където са локализирани ензимите
(при ензимохистохимичните методики).
Видове хистохимични методики
Доказване на гликоген:
1. Оцветяване с кармин по Бест.
2. ПАС реакция на Хочкинс и Мак Манус. Тъй като
освен гликогенът се позитивират и други полизахариди,
задължително се провежда контролна реакция с алфа-
амилаза или диастаза, които хидролизират гликогена.
Доказване на гликозамингликани (ГАГ).
Реакциите се основават на използването на мета-
хроматични оцветители: толуидиново синьо, алциано-
во синьо, азур А, метиленово синьо, генцианвиолет.
Доказване на гликопротеини: използва се предим-
но ПАС реакция.Доказване на липиди:
 1. Неутрални липиди—Нилблау сулфат, Судан III и
IV, Ойл ред, Осмиева киселина, метод на Марчи за
миелинова дегенерация.
2. Сложни липиди—лецитин,сфингомиелин и др.:
Луксол-фаст блу, Билшовски, Нилблау сулфат.
Доказване на нуклеинови киселини:
1. Метилгрюнпиронин—за доказване на РНК и ДНК.
2. Браше—за доказване на РНК.
3. Фьолген—за доказване на ДНК.
4. Акридин оранж-нуклеиновите киселини се доказ-
ват при луминисцентна микроскопия—ядрото флуорес-
цира зелено, а цитоплазмата и ядърцето—червено.
Методики за оцветяване на специфични клетъчни и
извънклетъчни структури, пигменти:
за колаген—Ван Гизон, трихромно оцветяване, азан;
за еластични влакна—с орсеин;
за ретикулни влакна—Гомори;
за мускулни влакна—азан, трихромно оцветяване,
РТАН;
за нервни влакна (аксони)—Бодиан;
за Нислова субстанция—Нисъл;
за глиални влакна—Холцер, РТАН;
за меланинов пигмент—Масон-Фонтана;
за хемосидерин—Перлс.
7. Имунохистохимично изследване
7.1. Същност. Имунната хистохимия е вариант на
хистохимията, при който определени продукти в клет-
ката или извънклетъчните структури (антигени) се
визуализират микроскопски на базата на извършване
на реакцията антиген/антитяло в тъканта.
7.2. Област на приложение. Имунната хистохимия
се прилага в морфологичната практика предимно в
областта на туморната диагностика, където тя решава
няколко проблема:
• определяне хистогенезата на анапластичните ту-
мори чрез прилагане на цитоскелетни, мембранни, ен-
зимни и хормонални маркери;
• определяне степента на малигненост на туморите
чрез маркерите за клетъчна пролиферация;
• типизиране и субтипизиране на лимфомите;
• определяне на туморната анаплазия чрез доказва-
не на туморноспецифични, онкофетални и туморноасо-
циирани антигени;
• доказване на вирусни антигени.
7.3. Имуноензимна лабораторна техника
А. Имуноцитохимично изследване (процедура)
 Извършва се върху цитологични препарати:
• Цитонамазката се фиксира в леден ацетон за 10 мин.;
• Промива се с буфериран химичен разтвор с рН 7,4;
• Прилага се процедурата за имунохистохимично
изследване.
Б. Имуннохистохимично изследване
Прилага се при хистологични препарати.
1. Криостатни срези. Късчетата тъкан след двукратно
промиване с БФР за 5 мин. се замразяват с течен азот
или въглероден двуокис. От материала се получават
криостатни срези с дебелина 5 микрона. Срезите се
фиксират в леден ацетон и се промиват с БФР за 10 мин.
2. Парафинови срези. Късчетата тъканен материал се
фиксират в разтвора на Буен или неутрален формалин и
се включват в лесно топим парафин. Правят се срези с
дебелина 5 микрона и се монтират върху предметни стък-
ла посредством тъканен адхезив. След депарафиниране с
ксилол и алкохол се промиват с буфериран фосфатен раз-
твор. Следва имуннохистохимичното изследване.
3. Лабораторната технология на изследването про-
тича в три етапа:
I етап—инкубация с основните стандартизирани
антитела 24 часа при стайна температура;
II етап—свързващите кози и овчи антизаешки или
антимиши имуноглобулини, както и съответните ПАП,
РАР или АВС комплекси се прилагат за 20 мин.;
III етап—оцветяване с АЕС в ацетатет буфер при
рН 5,2 в присъствие на 1 % водороден прекис (Н2О2) за
40 мин. или с диаминобензидин за 10 мин. при същите
условия.
Забележка. Винаги се работи с негативна контрола,
която се води по същата процедура, но вместо първич-
но антитяло се накапва негативна контрола от набора.
8. Електронномикроскопско изследване
8.1. Същност. Методът е основан на високата раз-
ширителна способност на електронния микроскоп, кой-
то дава възможност да се наблюдават фините ултраст-
руктурни промени в клетъчните ядра и в органелите,
както и в извънклетъчните структури.