Държавен вестник, бр. 12, 2006 г., стр. 37

Б Р О Й  12
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
С Т Р .  37
7. Реакция за задържане на хемаглутинацията
Реагенти
1. Изотоничен фосфатно буфериран физиоло-
гичен разтвор (0,05 М) със стойност на рН между
7,0 и 7,4.
2. Алантоисна течност, съдържаща вируса на
НБП, разредена с PBS, така че да съдържа 4 хема-
глутинационни единици в единица обем.
3. 1 % суспензия от кокоши еритроцити.
4. Негативен контролен кокоши серум.
5. Позитивен контролен серум.
Процедури
1. Във всяка ямка на микротитърната плака
се накапват по 0,025 мл PBS (за предпочитане са
V-образните дъна на ямките).
2. В първата ямка се поставят 0,025 мл от тес-
твания серум.
3. След внимателно размесване от първата ямка
се прехвърлят по 0,025 мл във следващата, след
това от нея—в по-следващата и т. н., при което се
получават двукратни разреждания на серума, като
се започва от 1:2 и се достигне до 1:4096.
4. Добавят се по 0,025 мл разредена алантоисна
течност, съдържаща 4 хемаглутинационни единици.
5. Смесват се чрез внимателно потупване и се
поставят при 4 °С за най-малко 60 мин. или на стай-
на температура за най-малко 30 мин.
6. Добавят се по 0,025 мл 1 % суспензия на ерит-
роцити във всяка ямка.
7. Смесват се чрез внимателно потупване и
плаката се поставя при 4 °С.
8. Плаките се разчитат след 30—40 мин., кога-
то контролните червени кръвни телца са утаени.
Чрез накланянето им се отчита наличието или лип-
сата на отвесна черта, получена от стичането на
червените кръвни телца по същия начин както кон-
тролните проби, съдържащи само еритроцити
(0,025 мл) и PBS (0,05 мл).
9. Титърът на задържане на хемаглутинацията
представлява най-голямото разреждане на анти-
серума, предизвикващо пълна инхибиция на 4 хе-
маглутинационни единици вирус (при всеки тест
за задържане на хемаглутинацията се извършва
предварително титриране на вирусната суспензия
и определяне на 4 ХАЕ).
10. Резултатите се считат за валидни, ако при
отрицателния серум се получи титър 23 или по-
малък при 4 хемаглутинационни единици на виру-
са, а при положителния контролен серум се полу-
чи титър с най-много едно разреждане разлика от
известния му титър.
8. Определяне на интрацеребрален патогенен
индекс
1. Инфекциозна прясна алантоисна течност
(хемаглутинационният титър трябва да е по-голям
от 24) се разрежда 1:10 в стерилен изотоничен
физиологичен разтвор (без антитела).
2. От разредения изолат на вируса се инокули-
рат интрацеребрално по 0,05 мл в 10 еднодневни
пилета (40 часа след излюпване). Пилетата тряб-
ва да са получени от яйца, получени от специфич-
но, свободно от патогенни микроорганизми пти-
че стадо.
3. Птиците се наблюдават в продължение на 8
дни на 24-часови интервали.
4. При всяко наблюдение птиците се маркират
по следния начин: 0= норма; 1= болни; 2= мъртви.
5. Индексът се пресмята по следния начин:
Клинич-
Ден след инокулацията
ни приз-
(брой птици)
наци
1
2
3
4
5
6
7
8
об-
резул-
що
тат
норма
10
4
0
0
0
0
0
0
14 Ч 0
=0
болни
0
6
10
4
0
0
0
0
20 Ч 1
=20
мъртви
0
0
0
6
10
10
10 10
46 Ч 2
=92
Общо=112
Индексът представлява=112/80=1,4
9. Оценка на способността за формиране на
плаки
1. Използват се десетократни разреждания до
10-7 в изотоничен физиологичен разтвор, буфери-
ран с фосфат, за да се получат най-ясни плаки.
2. В петриеви панички се приготвят плътни
монослоеве от клетки на кокоши ембриони или
подходяща клетъчна линия (Мадин-Дарби говеж-
ди бъбреци) в диаметър 5 см.
3. По 0,2 мл от всеки разреден вирусен изолат
се добавят към петриевите панички и се оставя да
се абсорбира за 30 мин.
4. След трикратно измиване в изотоничен PBS
разтвор заразените клетки се покриват със среда,
съдържаща 1 % агар, 0,01 мг/мл трипсин (или без
трипсин). В посочената среда не се добавя серум.
5. След 72-часова инкубация при 37 °С получе-
ните плаки трябва да са с достатъчен размер. Те се
визуализират най-добре, когато покривният агар
се отстрани и клетъчният монослой се боядиса с
кристал виолет (0,5 %) в 25 % етанол.
6. Всички вируси трябва да дадат ясни плаки,
когато се инкубират с трипсин в покривния слой.
Когато не се добавя трипсин, само вируси, виру-
лентни за пилета, ще образуват плаки.
 Приложение № 5
към чл. 22, ал. 2, т. 7
Списък на национални лаборатории за
псевдочума
Белгия
Institut National de Recherches Vйtйrinaires
Groeselenberg 99
B-1180 Bruxelles
Дания
National Veterinary Laboratory
Poultry Disease Division
Hangшvej 2
DK-8200 Aarhus N.
Германия
Bundesforschungsanstalt fьr Viruskrankheiten der Tiere
Anstaltsteil Riems (Friedrich-Lцffler-Institut)
D-O-2201 Insel Riems