Държавен вестник, бр. 109, 2002 г., стр. 34

С Т Р .  34
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  109
(резервен разтвор). 20 ml от този разтвор се
разреждат до 100 ml със солна киселина (3.1). 1
ml от този разтвор съдържа 0,2 µmol тирозин.
4. Апаратура:
4.1. водна баня с температура 25,0 ± 0,1°C,
контролирана от ултратермостат;
4.2. спектрофотометър;
4.3. хронометър с точност 1 sec;
4.4. рН-метър.
5. Процедура
5.1. Приготвяне на разтвора (виж наблюде-
ние 7.1)
150 mg пепсин се разтварят в 100 ml солна
киселина (3.2). 2 ml от този разтвор се пренасят
с пипета в мерителна колба от 50 ml и обемът се
допълва със солна киселина (3.3). рН на разтво-
ра, проверен с рН-метър, трябва да бъде 1,6 ±
0,1. Колбата се потапя във водната баня (4.1).
5.2. Хидролизиране
5 ml от разтвора на хемоглобин (3.7) се пре-
насят с пипета в епруветка, нагряват се до 25°C
във водната баня (4.1), прибавя се 1 ml разтвор
на пепсин, получен както е описано в т. 5.1, и се
разбърква със стъклена пръчка с удебелен край,
като се правят около 10 движения напред—на-
зад. Епруветката се инкубира във водната баня
при 25°C в продължение на точно 10 min, счита-
но от момента на прибавянето на пепсиновия
разтвор (продължителността и температурата
трябва стриктно да се съблюдават). Прибавят
се 10 ml разтвор на трихлороцетна киселина (3.4),
предварително темперирана на 25°C, разбърк-
ва се и се филтрува през сух филтър.
5.3. Развитие на цветната реакция и измер-
ване на оптическата плътност
5 ml от филтрата се пренасят с пипета в ер-
ленмайерова колба от 50 ml, добавят се 10 ml
разтвор на натриева основа (3.5) и при постоян-
но разклащане се добавят 3 ml разреден реак-
тив на Folin-Ciocalteu (3.6). Оптическата плът-
ност на разтвора се определя след 5 до 10 min
със спектрофотометър при дължина на вълна-
та 750 nm и кювета с дебелина 1 сm срещу вода.
5.4. Празна проба
При всяко определяне се прави празна про-
ба, както следва:
5 ml от разтвора на хемоглобин (3.7) се пре-
насят с пипета в епруветка, нагряват се до 25°C
във водната баня (4.1), прибавят се 10 ml разт-
вор на трихлороцетна киселина (3.4), предвари-
телно темперирана на 25°C, разбърква се, при-
бавя се 1 ml разтвор на пепсин, получен както е
описано в т. 5.1. Разбърква се със стъклена пръч-
ка и епруветката се оставя във водната баня
(4.1) при 25°C точно за 10 min. Разбърква се и се
филтрува през сух филтър. Процедурата про-
дължава, както е описано в т. 5.3.
5.5. Калибровъчна крива
В ерленмайерови колби от 50 ml се пренасят
аликвоти от 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 и 5,0 ml от стандар-
тния разтвор на тирозин (3.8), отговарящи съ-
ответно на 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 и 1,0 µmol тирозин.
Серията се допълва със разтвор, несъдържащ
тирозин. Обемите се довеждат до 5 ml със солна
киселина (3.1). Добавят се 10 ml разтвор на
натриева основа (3.5) и при постоянно разбър-
кване се добавят 3 ml разреден разтвор на реак-
тива на Folin-Ciocalteu (3.6). Оптическата плът-
ност се измерва както е указано в последното
изречение на т. 5.3. Калибровъчната крива се
начертава, като стойностите за оптичната плът-
ност се нанасят срещу стойностите, съответст-
ващи на количествата на тирозина.
6. Пресмятане на резултатите
От калибриращата крива се отчита количес-
твото на тирозин в mol, съответстващо на опти-
ческата гъстота на цветния разтвор, коригиран
на основа на празната проба.
Активността на пепсина в mol на тирозина
при 25°C на mg за min се изчислява при следната
формула:
Свързване в mg ( U/mg) = 0,32а ,
              p
където:
a е количеството тирозин в mol, отчетено на
калибриращата крива;
р—теглото в mg на количеството пепсин,
посочено в 5.2.
7. Наблюдения
7.1. Количеството на разтворения пепсин
трябва да бъде такова, че при фотометричните
измервания в края и началото на серията оп-
тичната плътност да бъде в границите между
0,035 и 0,35.
7.2. Две единици / mg, получени по този метод,
отговарят на: 3,64 милиединици / mg по Anson
(µmol тирозин / mg / min при 35,5°C) или 36 400
търговски единици / g (µmol тирозин / g /10 min
при 35,5 °C).
ХХV. Определяне на свободен и общ госи-
пол
1. Цел и обхват
Този метод дава възможност да се опреде-
лят нивото на свободния госипол, общият госи-
пол и химически сродните субстанции в памуч-
но семе, брашно от памучно семе, в кюспе от
памучно семе и в комбинирани продукти за
изхранване на животни, съдържащи тези субс-
танции, когато концентрацията надвишава
20 ppm.
2. Принцип
Свободният госипол се определя чрез екст-
ракция в присъствие на 3-аминопропан-1-ол или
със смес от пропан-2-ол и хексан. Общият госи-
пол се определя чрез екстракция с диметилфор-
мамид. Чрез анилин госиполът се превръща в
госипол-дианилин, чиято оптическа плътност
се измерва при 440 nm.
3. Реактиви:
3.1. смес от пропан-2-ол и хексан: 60 обемни
части пропан-2-ол ч.з.а. се смесват с 40 обемни
части n-хексан;
3.2. разтворител А—в еднолитрова мерител-
на колба се смесват около 500 ml от сместа
пропан-2-ол и хексан (3.1) 2 ml 3-аминопропан-
1-ол, 8 ml ледена оцетна киселина и 50 ml вода.