Държавен вестник, бр. 68, 2014 г., стр. 83

БРОЙ  68	
Д Ъ Р Ж А В Е Н  В Е С Т Н И К 	
СТР.  83  
6.2. Хроматография
6.2.1. Градиент на подвижната фаза
Време
(min)
Разтворител І 
( %V/V) (4.5.1)
Разтворител ІІ 
( %V/V) (4.5.2)
0
50
50
15
65
35
30
65
35
45
50
50
6.2.2. Скорост на потока на подвижната фаза 
(т. 6.2.1) до 1,5 cm3 (ml)/min и температура на 
колоната до 35 °С.
6.2.3. Дължина на вълната на детекто­
ра – 264 nm.
6.2.4. Инжектират се 10 µl от всеки стандартен 
разтвор (т. 4.10) и се записват хроматограмите им.
6.2.5. Инжектират се 10 µl от разтвора на 
пробата (т. 6.1) и се записва хроматограмата.
6.3. Идентифицира се присъствието на хекса­
мидин, дибромохексамидин, дибромопропамидин 
или хлорхексидин, като се сравняват времената 
на задържане на записаните пикове в т. 6.2.5 с 
тези, получени от стандартните разтвори в т. 6.2.4.
7. Определяне
7.1. Подготовка на стандартни разтвори. 
Използва се един от консервантите (т. 4.6 до 
т. 4.9), който липсва в мострата, като вътрешен 
стандарт. Ако това не е възможно, препоръчва 
се да се използва триклокарбан (т. 4.11) или 
халокарбан (т. 4.12).
7.1.1. Изходен разтвор на консерванта 0,05 % 
(М/V), идентифициран в т. 6.3, в разтворител 
І (т. 4.5.1).
7.1.2. Изходен разтвор на консерванта 0,05 % 
(М/V), избран като вътрешен стандарт, в раз­
творител І (т. 4.5.1).
7.1.3. За всеки идентифициран консервант се 
приготвят 4 стандартни разтвора, като се от­
мерват в серия от 10 сm3 (ml) мерителни колби 
подходящи количества от изходния разтвор на 
идентифицирания консервант (т. 7.1.1) и подходя­
щи количества от изходния разтвор на вътреш­
ния стандарт (т. 7.1.2) според долната таблица. 
Всяка колба се долива до необходимия обем с 
разтворител І (т. 4.5.1) и се разбърква.
Стандар­
тен раз­
твор
Вътрешен 
стандартен
изходен 
разтвор
Изходен разтвор на 
идентифицирания кон­
сервант
добаве­
ни сm3 (ml)
(т. 7.1.2)
добавени
сm3 (ml) 
(т. 7.1.1)
µg/cm3 (ml)
(*)
І
1,0
0,5
25
ІІ
1,0
1,0
50
ІІІ
1,0
1,5
75
ІV
1,0
2,0
100
(*) Тези стойности са дадени като индикация 
и отговарят на концентрациите на идентифици­
раните консерванти в приготвените стандартни 
разтвори, изхождайки от изходния разтвор, 
съдържащ точно 0,05 % от идентифицирания 
консервант.
7.2. Подготовка на пробата.
7.2.1. Претегля се около 0,5 g (р) с точност 
0,001 g от пробата в мерителна колба от 10 cm3 
(ml), добавят се 1,0 cm3 (ml) от вътрешния стан­
дартен разтвор (т. 7.1.2) и 6 cm3 (ml) от разтво­
рител І (т. 4.5.1) и се разбърква.
7.2.2. Колбата се поставя в ултразвукова вана 
(т. 5.4) за 10 min. Охлажда се. Долива се до не­
обходимия обем с разтворител І и се разбърква. 
Центрофугира се или се филтрува през нагъната 
филтърна хартия. Събира се горната фаза или 
филтратът за хроматографиране.
7.3. Хроматография
7.3.1. Градиентът на подвижната фаза, ско­
ростта на потока, температурата на колоната и 
дължината на вълната на детектора на HPLC 
(т. 5.2) са, както е препоръчано при етап иден­
тификация (т. 6.2.1 до т. 6.2.3).
7.3.2. Инжектират се 10 µl от разтвора на 
пробата (т. 7.2.2) и се измерват пиковите площи. 
Повтаря се процесът с инжектиране на 10 µl от 
разтвора на пробата, докато се получат посто­
янни резултати. Изчислява се съотношението 
на пиковата площ, получена от анализираната 
проба, с пиковата площ, получена от вътрешния 
стандарт.
7.4. Калибриране 
7.4.1. Инжектират се 10 µl от всички стандартни 
разтвори (т. 7.1.3) и се измерват пиковите площи.
7.4.2. За всеки стандартен разтвор (т. 7.1.3) се 
изчислява съотношението на пиковите площи на 
хексамидина, дибромохексамидина, дибромопро­
памидина или хлорхексидина спрямо пиковата 
площ на вътрешния стандарт. Начертава се 
стандартна крива, като на ординатата се нанасят 
тези съотношения, а на абсцисата – съответните 
концентрации на идентифицираните консерванти 
в стандартните разтвори, в µg/cm3 (ml).
7.4.3. От стандартната крива (т. 7.4.2) се 
отчитат концентрациите на идентифицираните 
консерванти, съответсващи на изчислените пи­
кови площи в т. 7.3.2.
8. Изчисления
8.1.1.Съдържанието на хексамидин, дибромо­
хексамидин, дибромопропамидин или хлорхекси­
дин в пробата, като % (M/M) се изчислява по 
следната формула:
 
,
където:
р е масата на анализираната проба (т. 7.2.1) в g;
с – концентрацията на консерванта в разтвора 
на пробата, отчетена от стандартната крива в 
µg/cm3 (ml); 
МW1 – молекулното тегло на основната форма 
присъстващ консервант;
МW2 – молекулното тегло на съответната сол 
(виж т. 10).
9. Повторяемост *
За концентрация 0,1 % (М/М) на хексамиди­
на, дибромохексамидина, дибромопропамидина 
или хлорхексидина разликата в резултатите на 
две паралелно проведени определения на една 
и съща проба не трябва да надвишава 0,005 %. 
*Забележка. Виж ISO 5725.