Държавен вестник, бр. 68, 2014 г., стр. 86

СТР.  86	
Д Ъ Р Ж А В Е Н  В Е С Т Н И К 	
БРОЙ  68
Приготвя се разтвор, който съдържа около 
1 g с точност 0,001 g 2-метоксибензоена киселина 
(т. 2.12) в 500 cm3 (ml) смес етанол-вода (т. 2.13).
2.15. Подвижна фаза за ВЕТХ.
2.15.1. Ацетатен буфер: към 1 dm3 (l) вода се 
прибавят 6,35 g натриев ацетат (т. 2.7) и 20,0 cm3 
(ml) оцетна киселина (т. 2.8) и се разбърква.
2.15.2. Подвижната фаза се приготвя чрез 
смесване на 9 обема ацетатен буфер (т. 2.15.1) и 
един обем ацетонитрил (т. 2.9).
2.16. Основен разтвор на консервантите
Претеглят се с точност 0,001 g около 0,05 g 
4-хидроксибензоена киселина (т. 2.3), 0,2 g сали­
цилова киселина (т. 2.4), 0,2 g бензоена киселина 
(т. 2.5) и 0,05 g сорбинова киселина (т. 2.6) в 
мерителна колба от 50 cm3 (ml) и се долива се 
до марката със смес етанол-вода (т. 2.13). Раз­
творът се съхранява в хладилник и е стабилен 
в продължение на една седмица.
2.17. Стандартни разтвори на консервантите
В серия от мерителни колби от 20 cm3 (ml) се 
поставят съответно 8,00; 4,00; 2,00; 1,00 и 0,50 cm3 
(ml) от основния разтвор (т. 2.16). Във всяка кол­
ба се прибавят по 10,00 cm3 (ml) от разтвора на 
вътрешен стандарт (т. 2.14) и по 0,5 cm3 (ml) 2 М 
сярна киселина (т. 2.10). Допълва се до марката 
със смес етанол-вода (т. 2.13). Тези разтвори се 
приготвят непосредствено преди употреба.
3. Апаратура
Стандартно лабораторно оборудване.
3.1. Водна баня, нагласена на 60 °С.
3.2. Високоефективен течен хроматограф с 
УВ детектор с променлива дължина на вълната 
и 10 µl дозираща капиляра.
3.3. Аналитична колона
Неръждаема стомана, дължина – 12,5 до 25 cm, 
вътрешен диаметър – 4,6 mm, пълнеж – Nucleosil 
5C18 или еквивалентен.
3.4. Филтърна хартия, диаметър 90 mm, 
Schleicher & Schull, № 5892, бяла лента или ек­
вивалентна.
3.5. Стъклени епруветки от 50 cm3 (ml) със 
запушалки на винт.
3.6. Стъклени шишенца за проби от 5 cm3 (ml).
3.7. Парченца карборунд за кипене, размер 2 
до 4 mm или еквивалентни.
4. Процедура
4.1. Приготвяне на пробата
4.1.1. Приготвяне на проба без добавяне на 
вътрешен стандарт
В стъклена епруветка (т. 3.5) от 50 cm3 (ml) 
се претегля 1 g от пробата с точност 0,001 g. 
С пипета в епруветката се прибавя 1,00 cm3 
(ml) 2 М сярна киселина (т. 2.10) и 40 cm3 (ml) 
смес етанол-вода (т. 2.13). Прибавя се около 
1 g карборунд (т. 3.7), епруветката се затваря и 
се разклаща енергично поне 1 min, докато се 
получи хомогенна суспензия. За улесняване на 
екстракцията на консервантите в етанолната фаза 
епруветката се поставя във водна баня (т. 3.1), 
нагласена на 60 °С точно за 5 min.
Епруветката се охлажда незабавно със студена 
вода и екстрактът престоява 1 h при температура 
5 °С и се филтрува през филтърна хартия (т. 3.4). 
Около 2 cm3 (ml) от екстракта се прехвърлят в 
шишенце за проби (т. 3.6). Екстрактът се съх­
ранява при 5 °С и се анализира чрез ВЕТХ в 
рамките на 24 h от приготвянето.
4.1.2. Приготвяне на проба с добавяне на 
вътрешен стандарт
В стъклена епруветка от 50 cm3 (ml) (т. 3.5) 
се претегля 1 g от пробата с точност 0,001 g. 
С пипета в епруветката се прибавя 1,00 cm3 
(ml) 2 М сярна киселина (т. 2.10) и 30 cm3 (ml) 
смес етанол-вода (т. 2.13). Прибавя се около 1 g 
карборунд (т. 3.7) и 10,00 cm3 (ml) разтвор на 
вътрешен стандарт (2.14), епруветката се затваря 
и се разклаща енергично поне 1 min, докато се 
получи хомогенна суспензия. За улесняване на 
екстракцията на консервантите в етанолната 
фаза епруветката се поставя във водна баня при 
60 °С точно за 5 min.
Епруветката се охлажда незабавно със студена 
вода и екстрактът престоява 1 h при температура 
5 °С и се филтрува през филтърна хартия (т. 3.4). 
Около 2 cm3 (ml) от екстракта се прехвърлят 
във шишенце за проби (т. 3.6). Екстрактът се 
съхранява при 5 °С и се анализира чрез ВЕТХ 
в рамките на 24 h от приготвянето.
4.2. Високоефективна течна хроматография
Подвижна фаза: ацетонитрил/ацетатен буфер 
(т. 2.15).
Скоростта на подвижната фаза през колоната 
се нагласява на 2,0±0,5 cm3 (ml)/min. Детекторът 
се настройва на 240 nm.
4.2.1. Стандартна крива
В течния хроматограф (т. 3.2) се дозират по 
10 µl от всеки от стандартните разтвори на кон­
сервантите (т. 2.17). За всеки разтвор се определя 
отношението между височината на пиковете 
на изследваните консерванти към височината 
на пика на вътрешния стандарт, получени от 
хроматограмите. Построява се графика за всеки 
консервант, като се нанасят отношенията на 
височините на пика спрямо съответните кон­
центрации на всеки стандартен разтвор.
Проверява се дали получените зависимости 
за всеки стандартен разтвор са линейни.
4.2.2. Определяне
В течния хроматограф се дозират 10 µl от 
екстракта на пробата (т. 4.1.1) и се записва хро­
матограмата. Дозират се 10 µl от стандартния 
разтвор на консерванти (т. 2.17) и се записва 
хроматограмата. Сравняват се получените хро­
матограми. Ако в хроматограмата на екстракта 
на пробата (т. 4.1.1) няма пик с приблизително 
същото време на задържане както това на 2-меток­
сибензоената киселина (препоръчвания вътрешен 
стандарт), в течния хроматограф се дозират 10 
µl от екстракта на пробата с добавен вътрешен 
стандарт (т. 4.1.2) и се записва хроматограмата.
Ако на хроматограмата на екстракта от проба­
та (т. 4.1.1) се наблюдава пречещ пик, който има 
време на задържане като на 2-метоксибезоената 
киселина, трябва да се избере друг подходящ 
вътрешен стандарт. (Ако един от изследваните 
консерванти отсъства от хроматограмата, този 
консервант може да бъде използван като вътре­
шен стандарт.)