Държавен вестник, бр. 101, 2005 г., стр. 146

С Т Р .  146
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  101
Смесват се 5 обема тетрахидрофуран, 60 обема
вода, 10 обема метанол и 25 обема ацетонитрил.
4.18. Изходни стандартни разтвори на консер-
вантите. Претеглят се с точност 0,001 g 0,2 g 2-фе-
ноксиетанол, 0,2 g 1-феноксипропан-2-ол, 0,05 g ме-
тилпарабен, 0,05 g етилпарабен, 0,05 g бутилпара-
бен и 0,025 g бензилпарабен в мерителни колби от
100 cm3 (ml) и разтворите се доливат до марката
със смес етанол/вода (4.15).
Разтворите са стабилни до една седмица при
съхраняване в хладилник.
4.19. Стандартни разтвори на консервантите.
От изходните стандартни разтвори (4.18) се прех-
върлят съответно 20,00 cm3 (ml), 10 cm3 (ml)
5,00 cm3 (ml), 2,00 cm3 (ml) и 1,00 cm3 (ml) в мери-
телни колби от 50 cm3 (ml). Във всяка колба се
прибавят по 10 cm3 (ml) разтвор на вътрешния стан-
дарт (4.16) и 1,0 cm3 (ml) разтвор на сярна кисели-
на (4.14) и се долива до марката със смес етанол/
вода (4.15). Разтворите трябва да са приготвени
непосредствено преди употреба.
5. Апаратура
Стандартно лабораторно оборудване и:
5.1. Водна баня с възможност за поддържане на
температура 60 °С ± 1 °С.
5.2. Хроматограф за високоефективна течна
хроматография с УВ детектор, дължина на вълна-
та 280 nm.
5.3. Аналитична колона от неръждаема стома-
на 25 cm Ч 4,6 mm (или 12,5 cm Ч 4,6 mm), съдържа-
ща Nucleosil 5С18 или еквивалент (виж 10.1).
5.4. Стъклени колби от 100 cm3(ml) със запу-
шалки.
5.5. Пемза с размери на зърната от 2 mm до 4 mm.
6. Процедура
6.1. Подготовка на пробата.
6.1.1. Подготовка на пробата без добавяне на
вътрешен стандарт.
Претегля се около 1,0 g от пробата с точност
0,001 g в стъклена колба от 100 cm3 (ml) със запу-
шалка (5.4). Добавят се 1,0 cm3 (ml) разтвор на сярна
киселина (4.14), 50,0 cm3 (ml) етанол/водна смес
(4.15) и около 1,0 g пемза (5.5). Колбата се запушва
и се разклаща силно, докато се получи хомогенна
суспензия. За улесняване екстракцията на консер-
вантите в етаноловата фаза колбата се нагрява
5 min на водна баня (5.1) при температура 60 °С ±
1 °С. След това се охлажда бързо на течаща студе-
на вода и престоява в хладилник 1 h. Филтрува се
през книжен филтър и около 2 cm3 (ml) от филтра-
та се прехвърлят в епруветка от 5 сm3 (ml) със за-
пушалка. Екстрактът се съхранява в хладилник.
ВЕТХ определянето трябва да се извърши до 24 h.
6.1.2. Подготовка на пробата с добавяне на вът-
решен стандарт.
Претегля се около 1,0 g ± 0,1 от пробата с точ-
ност 0,001 g и се прехвърля в колба от 100 cm3 (ml).
Добавят се 1,0 cm3 (ml) разтвор на сярна киселина
(4.14) и 40 cm3 (ml) смес етанол/вода (4.15), около
1,0 g пемза (5.5) и точно 10,0 cm3 (ml) разтвор на
вътрешен стандарт (4.16). Колбата се запушва и се
разклаща силно най-малко 1 min, докато се полу-
чи хомогенна емулсия. За улесняване екстракци-
ята на консервантите в етаноловата фаза колбата
се загрява 5 min на водна баня при температура
60 °С ± 1 °С, след което се охлажда бързо на течаща
студена вода и престоява в хладилник 1 h. Филтру-
ва се през книжен филтър. Около 2 cm3 (ml) от фил-
трата се прехвърлят в епруветка от 5 cm3 (ml) със
запушалка. Съхранява се в хладилник до провеж-
дане на ВЕТХ определянето.
6.2. Високоефективна течна хроматография
(ВЕТХ).
6.2.1. Хроматографски условия:
Подвижна фаза—тетрахидрофуран/вода/мета-
нол/ацетонитрил (4.17)
Скорост на потока—1,5 cm3/min (ml/min)
Дължина на вълната—280 nm.
6.2.2. Стандартна крива.
Инжектират се по 10 µl от стандартните раз-
твори на консервантите (4.19). От получените хро-
матограми се определят съотношенията на висо-
чината на пиковете на стандартните разтвори на
консервантите към височината на пика на вътреш-
ния стандарт. Построява се крива за всеки консер-
вант, свързваща тези съотношения с концентра-
цията на стандартните разтвори.
6.2.3. Определяне.
Инжектират се последователно по 10 µl от раз-
твора на пробата без вътрешен стандарт (6.1.1.) и
на един от стандартните разтвори на консерванта
(4.19) и получените хроматограми се сравняват.
Ако в хроматограмата на пробата (6.1.1.) не се появи
пик с приблизително същото време на задържане
като това на изопропилпарабена (препоръчан като
вътрешен стандарт), се инжектират 10 µl разтвор
на пробата с вътрешен стандарт (6.1.2). Хромато-
грамата се изписва и се измерват височините на
пиковете. Ако в хроматограмата на пробата се
появи пречещ пик с приблизително същото време
на задържане като това на изопропилпарабена,
трябва да се избере друг вътрешен стандарт.
Когато пикът на някои от изследваните кон-
серванти не присъства в хроматограмата на про-
бата, този консервант може да се използва като
алтернативен вътрешен стандарт.
Изчисляват се съотношенията на височината
на пика на изследваните консерванти към тези на
вътрешния стандарт и се проверява дали за стан-
дартните разтвори, използвани в процедурата за
калибриране, се получава линейна зависимост.
Получените хроматограми на стандартния раз-
твор и на разтвора на пробата трябва да отговарят
на следните изисквания:
—Разделянето на пиковете (р) на най-лошо раз-
делената двойка трябва да бъде не по-малко от
0,90 (за дефиниция на пиково разделяне виж фиг. 1).
Ако не е постигнато необходимото разделяне,
трябва да се използва по-ефективна колона или
друга по състав подвижна фаза.
—Коефициентът на асиметрия (As) на всички
получени пикове трябва да бъде в интервала от 0,9
до 1,5 (за дефиницията на коефициент на асимет-
рия виж фиг. 2).
Препоръчва се хроматограмата за определяне
коефициента на асиметрия да се записва при ско-
рост най-малко 2 cm/min.
—Базовата линия трябва да е стабилна.
7. Изчисление
Изчисляването на концентрациите на консер-
вантите в разтвора на пробата се извършва по стан-
дартната крива (6.2.2) и съотношенията на висо-