Държавен вестник, бр. 27, 2007 г., стр. 29

Б Р О Й  27
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
С Т Р .  29
Bacto-Agar (Difco)
15,0 g
Дестилирана вода
1,0 L
Разтворете съставките и стерилизирайте в авто-
клав при 121 °C за 15 min.
Среда с минерални соли и екстракт от дрожди
(YGM)
Bacto-Yeast-Extract (Difco)
2,0 g
D(+) Глюкоза (монохидрат)
2,5 g
K2HPO4
0,25 g
KH2PO4
0,25 g
MgSO4.7H2O
0,1 g
MnSO4.H2O
0,015 g
NaCl
0,05 g
FeSO4.7H2O
0,005 g
Bacto-Agar (Difco)
18 g
Дестилирана вода
1,0 L
Разтворете съставките и стерилизирайте средата
в обеми от 0,5 литър—в автоклав при 115 °C за
20 min.
(б) Валидирани селективни хранителни среди
Среда MTNA
В случай че не е упоменато друго, всички ком-
поненти са от BDH.
Екстракт от дрожди (Difco)
2,0 g
Манитол
2,5 g
K2HPO4
0,25 g
KH2PO4
0,25 g
NaCl
0,05 g
MgSO4.7H2O
           0,1 g
MnSO4.H2O
0,015 g
FeSO4.7H2O
0,005 g
Агар (Oxoid no. 1)
16,0 g
Дестилирана вода
1,0 L
Разтворете съставките, коригирайте pH на 7,2.
След загряването в автоклав (при 121 °C за 15 min)
и охлаждане до 50 °C добавете антибиотици:
trimethoprim 0,06 g, nalidixic acid 0,002 g, amphotericin
B 0,01 g.
Разтваряне на антибиотиците до получаване на
крайна работна концентрация: Trimethoprim
(Sigma) и Nalidixic acid (Sigma) (и двете при 5 mg/
ml), в 96 % метанол, Amphotericin B (Sigma) (1 mg/
ml) в диметилов серен оксид.
Работните разтвори на антибиотиците трябва
да се съхраняват след стерилизиране през филтър.
Важно.
Годността на основната хранителна среда е три
месеца. След като се добавят антибиотици, трай-
ността е един месец, ако се съхранява в хладилник.
NCP-88 среда
Хранителен агар (Difco)
23 g
Екстракт от дрожди (Difco)
2 g
D-манитол
5 g
K2HPO4
2 g
KH2PO4
0,5 g
MgSO4.7H2O
0,25 g
Дестилирана вода
1,0 L
Разтворете съставките, коригирайте pH на
7,2. След загряването в автоклав (при 121 °C за
15 min) и охлаждане до 50 °C добавете следни-
те антибиотици: Polymyxin B sulphate (Sigma)
0,003 g, Nalidixic acid (Sigma) 0,008 g, Cycloheximide
(Sigma) 0,2 g.
Разтваряне на антибиотиците до получаване на
крайна работна концентрация, както следва:
nalidixic acid в 0,01 M NaOH, cycloheximide в 50 %
етанол, polymyxin B sulphate в дестилирана вода.
Работните разтвори на антибиотиците трябва да
се съхраняват след стерилизиране през филтър.
Важно. Годността на основната хранителна сре-
да е три месеца. След като се добавят антибиоти-
ци, трайността е един месец, ако се съхранява в
хладилник.
Допълнение 6
Валидирани PCR протоколи и реактиви
Важно.
Предварителното тестване трябва да позволи
възпроизводимо откриване на поне 103 до 104 клет-
ки от C. m. sepedonicus на ml екстракт от проба.
Предварителното тестване трябва също да не
показва положителни резултати с група от селек-
тирани щамове.
1. Многостранни протоколи с вътрешен PCR
контрол (Pastrik, 2000).
1.1. Олигонуклеотидни праймери
Начален праймер PSA-1
5'- ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa -3'
Краен праймер PSA-R
5'- tac tga gat gtt tca ctt ccc c -3'
Начален праймер NS-7-F 5'- gag gca ata aca ggt ctg tga tgc -3'
Краен праймер NS-8-R
5'- tcc gca ggt tca cct acg ga -3'
Очакваният размер на амплификата от модел
на ДНК от C. m. subsp. sepedonicus = 502 бд (PSA-
набор от праймери).
Очакваният размер на амплификата от 18S
рРНК при вътрешен контрол PCR = 377 бд (NS-
набор от праймери).
1.2. PCR реакционна смес
Реактив
Количество
Крайна
реактиви
концент-
за микс
рация
Стерилна UPW
15,725 µl
10x PCR буфер (1)
1 Ч
(15 mM MgCl2)
2,5 µl
(1,5 mM MgCl2)
BSA (фракция V) (10 %)
0,25 µl
0,1 %
d-nTP mix (20 mM)
0,125 µl
0,1 mM
Праймер PSA-1 (10 µM)
0,5 µl
0,2 µM
Праймер PSA-R (10 µM)
0,5 µl
0,2 µM
Праймер NS-7-F (10 µM) (2)
0,1 µl
0,04 µM
Праймер NS-8-R (10 µM) (2)
0,1 µl
0,04 µM
Taq polymerase (5 U/µl) (1)
0,2 µl
1,0 U
Обем на пробата
5,0 µl
Общ обем
25,0 µl
(1)
Методите са били валидирани чрез използване на
Taq полимераза от Perkin Elmer (AmpliTaq или
Gold) и Gibco BRL.
(2)
Концентрацията на праймерите NS-7-F и NS-8-R е
била оптимизирана за екстракцията на конусчета-
та, като се използва методът на хомогенизиране и
пречистване на ДНК според Pastrik (2000) (вижте
раздел 6.1.a и 6.2). Реоптимизиране на концентра-
циите от реактивите ще се изисква, ако са изпол-
звани екстракция чрез разклащане или други ме-
тоди за изолиране.
1.3. Условия за протичане на PCR
Включете следната програма:
1 цикъл:
а) 3 min при 95 °C (денатурация на
матрична ДНК)
10 цикъла: б) 1 min при 95 °C (денатурация на
матрична ДНК)
в) 1 min при 64 °C (хибридизация
на праймерите)
г) 1 min при 72 °C (удължаване на
копието)