Държавен вестник, бр. 27, 2007 г., стр. 30

С Т Р .  30
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  27
25 цикъла: д) 30 s при 95 °C (денатурация на
матрична ДНК)
е) 30 s при 62 °C (хибридизация на
праймерите)
ж) 1 min при 72 °C (удължаване на
копието)
1 цикъл:
з) 5 min при 72 °C (крайно удължа-
ване на копието)
и) задържане при 4 °C.
Важно.
Тази програма е оптимизирана за използване с
MJ Research PTC 200 термоцикльор. Може да се
наложи модифициране на стъпките на циклите “б”,
“в”, “г”, “д”, “е” и “ж” при използване на други
модели.
1.4. Анализ на амплификата с рестриктазен
ензим
PCR продуктите, получени от ДНК на C. m.
subsp. sepedonicus, дават ясно разграничим поли-
морфизъм на дължината на рестрицираните фраг-
менти с ензима Bgl II след инкубиране при 37 °C за
30 min. Рестрикционните фрагменти, получени от
специфичен за C. m. subsp. sepedonicus фрагмент,
са с размер 282 бд и 220 бд.
2. Приготвяне на буфер за електрофореза
2.1. Bromphenol blue (10 % готов разтвор)
Bromphenol blue
5 g
Дестилирана вода (бидестилирана)
50 ml
2.2. Натоварващ буфер
Глицерол (86 %)
3,5 ml
Bromphenol blue (5.1)
300 µl
Дестилирана вода (бидестилирана)
6,2 ml
3. 10x Трис ацетат EDTA (TAE) буфер, pH 8,0
Tris буфер
48,4 g
Ледена оцетна киселина
11,42 ml
EDTA (дикалиева сол)
3,72 g
Дестилирана вода
1,00 L
Разтворете до 1x преди употреба.
Налични и в търговската мрежа (напр. Invitrogen
или подобни).
Допълнение 7
Валидирани реактиви за FISH тест
1. Олиго-сонди
Cms-специфична
проба CMS-CY3-01:
5'- ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg -3'
Неспецифична
еубактериална проба
EUB-338-FITC:
5'- gct gcc tcc cgt agg agt -3'
2. Фиксиращ разтвор
[ВНИМАНИЕ! ФИКСАТОРЪТ СЪДЪРЖА
ПАРАФОРМАЛДЕХИД, КОЙТО Е ТОКСИЧЕН,
НОСЕТЕ РЪКАВИЦИ И НЕ ВДИШВАЙТЕ. ПРЕ-
ПОРЪЧИТЕЛНО Е ДА СЕ РАБОТИ В ИЗОЛА-
ЦИОННА КАМЕРА].
а) Загрейте 9 ml вода за молекулярен анализ
(напр. ултрачиста вода до 60 °C) и прибавете 0,4 g
параформалдехид. Параформалдехидът се разтва-
ря след прибавяне на пет капки 1N NaOH и разбър-
кване с магнитна бъркалка.
б) Нагласете pH до 7,0 чрез прибавяне на 1ml
0,1 M фосфатен буфер (PB; pH 7,0) и пет капки 1 N
HCl. Проверете pH с индикаторна лентичка и го
коригирайте, ако е необходимо, с HCl или NaOH.
[ВНИМАНИЕ! НЕ ИЗПОЛЗВАЙТЕ PH МЕ-
ТЪР В РАЗТВОРИ С ПАРАФОРМАЛДЕХИД.]
в) Филтрирайте разтвора през 0,22 µm мембра-
нен филтър и го пазете от прах при 4 °C до следва-
ща употреба.
г) Важно.
Алтернативни фиксиращи разтвори: 96 % етанол.
3. 3x Hybmix
NaCl
2,7 M
Tris-HCl
60 mM (pH 7,4)
EDTA (филтърно
стерилизирана или на
автоклав)
 —15 mM
Разредете до 1x, както се изисква.
4. Хибридизационен разтвор
1x Hybmix
Sodium dodecyl sulphate (SDS)
0,01 %
проба EUB 338                                    5 ng/µl
проба CMSCY301
5 ng/µl
Пригответе количествата от разтвора за хиб-
ридизация според изчисленията в таблицата. За
всяко предметно стъкло (съдържащо две различ-
ни проби в дубликат) са необходими 90 µl хибриди-
зационен разтвор.
Таблица. Примерни количества за приготвяне
на хибридизационна смес
2 препарата 8 препарата
Стерилна УЧВ
50,1
200,4
3x хибмикс
30,0
120,0
1 % SDS
0,9
3,6
Сонда EUB 338 (100 ng/µl)
4,5
18,0
Сонда CMSCY301 (100 ng/µl)
4,5
18,0
Общ обем (µl)
90,0
360,0
Важно. Съхранявайте всички разтвори, съдържа-
щи чувствителни на светлина олигосонди, на тъмно,
при—20 °C. Пазете ги от пряка слънчева или елект-
рическа светлина по време на използване.
5. 0,1M фосфатен буфер, pH 7,0
Na2HPO4
8,52 g
KH2PO4
5,44 g
Дестилирана вода
1,00 L
Разтворете съставките, проверете pH и стери-
лизирайте в автоклав при 121 °C за 15 min.
Допълнение 8
Култура от патладжан
Посейте семена от патладжан (Solanum
melongena) в пастьоризиран компост за семенa.
След появата на напълно развити семедели (от
10 до 14 дни) и на първи същински лист растени-
ята се пикират в пастьоризиран компост за за-
саждане.
Патладжанените растения трябва да се отглеж-
дат в оранжерия със следните условия на средата:
Продължителност на деня:
14 h или естествена
дневна продължи-
телност, ако тя е
по-голяма;
Температура:
дневна:
21 до 24 °C,
нощна:
15 °C.
Чувствителни сортове патладжан: “Black Beauty”,
“Long Tom”,
“Rima”,
“Balsas”