Държавен вестник, бр. 109, 2002 г., стр. 80

С Т Р .  80
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  109
100 mg ВНТ (3.13), 2 ml разтвор на  натриев
аскорбат (3.5) и 2 ml разтвор на натриев сулфид
(3.6). Хладникът се свързва (4.3) към колбата
и тя се потапя във водна вана с магнитна бър-
калка (4.7). Загрява се до кипене и се оставя да
се нагрее с обратен хладник за 5 min. След това
се добавят 25 ml разтвор на калиев хидроксид
(3.4) през хладника (4.3) и се оставя да се наг-
рее с обратен хладник за още 25 min, като се
разбърква под азотна струя. След това хладни-
кът се измива с приблизително 20 ml вода и
съдържанието на колбата се охлажда до стай-
на температура.
5.3. Извличане
Осапуняващият разтвор се прехвърля коли-
чествено чрез декантиране с измиване с общ
обем от 250 ml вода в 1000 ml разделяща фуния
(4.2.3) или в екстракционния апарат (4.8). Оса-
пунисващата колба се измива последователно с
25 ml етанол (3.1) и 100 ml петролен етер (3.2) и
отмитото се прехвърля в разделящата фуния или
в екстракционния апарат. Пропорцията на во-
дата и етанола в комбинираните разтвори трябва
да бъде около 2:1. Разтръсква се  енергично 2
min се оставя да се утаи 2 min.
5.3.1. Екстракция с използване на раздели-
телна фуния (4.2.3)
Когато слоевете са се разделили (вж. забе-
лежка 7.3) слоят на петролевият етер се прех-
върля в друга разделителна фуния (4.2.3). Тази
екстракция се повтаря 2 пъти със 100 ml пет-
ролев етер (3.2) и два пъти с 50 ml петролев
етер (3.2).
Комбинираните екстракти в разделящите
фунии се измиват два пъти чрез внимателно
завихряне (за да се избегне образуването на
емулсии) със 100 ml вода и след това чрез пов-
торно разтръскване с нови 100 ml вода, докато
водата остане безцветна при добавяне на раз-
твор на фенолфталеин (3.7) (измиването чети-
ри пъти обикновено е достатъчно). Измитият
екстракт се филтрира през сух нагънат филтър
за фазово разделяне (4.4), за да се отстрани сус-
пендирана вода, в мерителна колба от 500 ml
(4.2.2). Разделителната фуния и филтърът се
измиват с 50 ml петролев етер (3.2), долива се до
отметката с петролев етер (3.2) и се смесва добре.
5.3.2. Екстракция с използване на екстрак-
ционен апарат (4.8)
Когато слоевете са се разделили (вж. забе-
лежка 7.3), запушалката на стъкления цилин-
дър се заменя (4.8.1) със загладена стъклена
вложка (4.8.2) и долният край с U-форма на регу-
лируемата тръба се разполага така, че тя да е
точно над нивото на интерфейса. Чрез прилага-
не на налягане от азотна линия на страничното
рамо горният слой петролев етер се прехвърля
в разделителна фуния от 1000 ml (4.2.3). Доба-
вят се 100 ml петролев етер (3.2) в стъкления
цилиндър, запушва се и се разтръсква добре.
Слоевете се оставят да се разделят и горният
слой се прехвърля в разделителната фуния как-
то преди. Екстракционната процедура се пов-
таря с допълнителни 100 ml петролев етер (3.2),
след това два пъти с 50 ml части петролев етер
(3.2) и слоевете петролев етер се добавят в раз-
делителната фуния.
Комбинираните екстракти на петролев етер
се измиват, както е описано в 5.3.1, и се
продължава, както е описано там.
5.4. Приготвяне на разтвор на образеца за HPLC
Отпипетирва се аликвотна част на разтвора
на петролевия етер (от 5.3.1 или 5.3.2) в крушо-
видна колба от 250 ml (4.2.4). Разтворителят се
изпарява почти до сухо на ротационния изпа-
рител (4.1) с намалено налягане при температу-
ра на ваната непревишаваща 40 °С. Атмосфер-
ното налягане се възстановява чрез допускане
на азот (3.10) и колбата се маха от ротационния
изпарител. Останалият разтворител се отстра-
нява с поток на азот (3.10) и остатъкът незабав-
но се разтваря в известен обем (10-100 ml) мета-
нол (3.3) (концентрацията на витамин А трябва
да бъде в обхвата от 5 до 30 IU/ml).
5.5 Определяне с HPLC
Витамин А се отделя в С18 колона обърната
фаза (4.5.1) и концентрацията се измерва пос-
редством УВ детектор (325 nm) или флуорес-
центен детектор (възбуждане: 325 nm, емисия
475 nm) (4.5.2).
Аликвoтна част 20 µl метанолов разтвор,
получен в 5.4, се инжектира и се разрежда с
мобилната фаза (3.9). Изчисляват се средноа-
ритметичната височина (площ) на пика на ня-
колко инжектирания на разтвор на същата про-
ба и средноаритметичната височина (площ) на
пика на няколко инжектирания на разтвор на
калиброващи разтвори (5.6.2).
HPLC условия
Следните условия се предлагат като насока.
Могат да се използват други условия при усло-
вие, че дават еквивалентни резултати.
Течнa хроматографска колона (4.5.1)—
250 mm х 4 mm, С18,5 или 10 пълнеж µm или
еквивалентен
Подвижна фаза—смес от метанол (3.3) и вода,
е.g. 980+20 ( v+v)
скорост на изтичане—1-2 ml/min
дедектор(4.5.2.)—УВ детектор (325 nm) или
флуоресцентен, с регулиране дължината на въл-
ната 325 nm, 475 nm.
5.6. Калибриране
5.6.1. Приготвяне на работни еталонни
разтвори
Отпипетирват се 20 ml изходен разтвор на
ацетат на витамин А (3.11.1) или 20 ml изходен
разтвор на палмитат на витамин А (3.12.1) в плос-
кодънна и ерленмайерова колба от 500 ml (4.2.1)
и се хидролизират, както е описано в 5.2, но без
добавяне на ВНТ. След това се извлича с петро-
лев етер (3.2) съгласно 5.3 и се долива до 500 ml
петролев етер (3.2). 100 ml от този екстракт се
изпаряват на ротационен изпарител (вж. 5.4) почти
до сухо, останалият разтворител се отстранява с
азотна струя (3.10) и остатъкът се разтваря отново
в 10 ml метанол (3.3). Номиналната концентра-