Държавен вестник, бр. 28, 2007 г., стр. 50

С Т Р .  50
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  28
7. Методи за характеризиране на щама
Препоръчва се един от следните методи за ха-
рактеризиране на щама за всеки нов случай на
изолиране на R. solanacearum.
За всеки направен тест се включват познати
референтни щамове (виж Допълнение 3).
7.1. Определяне на биовара
R. solanacearum е разделена на биовари въз
основа на способността за утилизация и/или окис-
ляване на три дизахариди и три хексоза алкохо-
ли (Hayward, 1964, и Hayward et al., 1990). В При-
ложение 2 е дадено описание на хранителните
среди за тестване на биовара. Тестът може да се
извърши успешно, като средите се инокулират
чрез пробождане с чисти култури на изолати на
R. solanacearum и се инкубират при 28 °С. Ако
средите се разпределят в стерилни плаки с 96
гнезда (200 µl за гнездо), може да се наблюдава
промяна в цвета от маслиненозелено в жълто в
рамките на 72 часа, което означава положите-
лен резултат от теста.
Биовар
1
2
3
4
5
Усвояване на:
Малтоза
-
+
+
-
+
Лактоза
-
+
+
-
+
D (+) Целобиоза
-
+
+
-
+
Манитол
-
-
+
+
+
Сорбитол
-
-
+
+
-
Дулцитол
-
-
+
+
-
Допълнителните тестове позволяват разграничава-
нето на биовар 2 в подфенотипове
Биовар 2А
Биовар 2А Биовар 2Т
(световно
(разпрост- (разпрост-
разпростра-
ранен в
ранен в
нение)
Чили и
тропич-
Колумбия) ните зони)
Усвояване на
трехалоза
-
+
+
Усвояване на
мезо-инозитол
+
-
+
Усвояване на
D рибоза
-
-
+
Пектолитична
активност (1)
ниска
ниска
висока
(1) Виж Lelliott и Stead (1987)
7.2. Геномен отпечатък:
Следните процедури позволяват да бъде извър-
шено молекулно диференциране на щамовете в
комплекса на R. solanacearum:
7.2.1. Анализ на полиморфизма по дължината
на рестрикционните фрагменти (RELP) (Cook et
al., 1989).
7.2.2. PCR с повтаряща се последователност,
използваща REP, BOX и ERIC праймери (Louws et
al., 1995; Smith et al., 1995).
7.2.3. Анализ на полиморфизмите по дължина-
та на амплифицираните фрагменти (AFLP) (Van
der Wolf et al., 1998).
7.3. PCR методи
Специфичните PCR праймери могат да се из-
ползват за диференциране на щамове от раса 1
(биовари 3, 4 и 5) и раса 2 (биовари 1, 2A и 2T) на
R. solanacearum, първоначално определени чрез
RFLP анализ (Cook et al., 1989) и секвениране на
16S рДНК (Taghavi et al., 1996).
В. Тест за потвърждаване
Тестът за патогенност трябва да се направи
като окончателно потвърждаване на диагности-
циране на R. solanacearum и за потвърждаване на
вирулентността на идентични култури, идентифи-
цирани като R. solanacearum.
1) Приготвя се инокулум с приблизително 106
клетки на ml от 24- до 48-часова култура на изолата
за тестване и подходящ положителен контролен щам
на R. solanacearum (например NCPPB 4156 =
= PD 2762 = CFBP 3857; виж Допълнение 3).
2) Инокулират се 5 до 10 доматени растения
или растения патладжан във фаза трети същински
лист (виж раздел VI.А.9).
3) Инкубират се за не повече от две седмици
при температура 25 до 28 °С и висока относителна
влажност с подходящо напояване, за да се избегне
прекомерното поливане или стрес от засушаване.
При чистите култури типичното увяхване трябва
да се получи в рамките на 14 дни. Ако след този
период не са налице симптоми, не може да се пот-
върди, че културата е патогенна форма на R.
solanacearum.
4) Растенията се наблюдават за симптоми на
увяхване и/или епинастия, хлороза.
5) От растенията със симптоми се взема част
от стъблото на около 2 cm над точката на инокула-
ция. Стрива се в малко количество стерилна дес-
тилирана вода или 50 mM фосфатен буфер (Допъл-
нение 4). Прави се посявка от суспензията върху
подходяща среда, за предпочитане селективна среда
(Допълнение 2), петритата се инкубират за 48 до
72 часа при 28 °С и се наблюдава за появата на
колонии, типични за R. solanacearum.
Допълнение 1
Лаборатории, които участват в оптимизирането
и валидирането на протоколите
Лаборатория (1)
Място
Страна
1
2
3
Agentur fьr Gesundheit und
Ernдhrungssicherheit
Vienna, Linz
Австрия
Departement Gewasbescherming
Merelbeke
Белгия
Plantedirektoratet
Lyngby
Дания
Central Science Laboratory
York
Англия
Scottish Agricultural Science
Agency
Edinburgh
Шотландия
Laboratoire National de la
Protection des Vйgйtaux, Unitй
de Bactйriologie
Angers
Франция
Laboratoire National de la
Protection des Vйgйtaux,
Station de Quarantaine de la
Pomme de Terre
Le Rheu
Франция
Biologische Bundesanstalt
Kleinmachnow
Германия
Pflanzenschutzamt Hannover
Hannover
Германия
State Laboratory
Dublin
Ирландия
Dipartimento di Scienze e
Tecnologie Agroambientali
Bologna
Италия