Държавен вестник, бр. 28, 2007 г., стр. 55

Б Р О Й  28
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
С Т Р .  55
Очакван размер на фрагмент от R. solanacearum
матрична ДНК = 553 бд (базови двойки).
2.2. Микс за PCR реакцията
Реагент
Количество
Крайна кон-
за реакция
центрация
Стерилна ултрачиста вода
16,025 µl
10X PCR буфер (1)
2,5 µl
1X
(1,5 mM MgCl2)
BSA (фракция V) (10 %)
0,25 µl
0,1 %
d-nTP микс (20 mM)
0,125 µl
0,1 mM
Праймер Ps-1 (10 µM)
0,5 µl
0,2 µM
Праймер Ps-2 (10 µM)
0,5 µl
0,2 µM
Taq полимераза (5U/µl) (1)
0,1 µl
0,5 U
Обем на пробата
5,0 µl
Общ обем:
25,0 µl
(1) Методите са валидирани, като е използвана Taq по-
лимераза от Perkin Elmer (AmpliTaq) и Gibco BRL.
N.B. Първоначално оптимизирани за MJ Research PTC
200 термоцикльор с Gibco Taq полимераза.
Perkin Elmer AmpliTaq и буфер могат също да се изпол-
зват при същите концентрации.
2.3. Условия за PCR реакцията
Преминава се следната програма:
1 цикъл от
а) 5 минути при 95 °С (денатурация
на матрична ДНК)
35 цикъла от
б) 30 секунди при 95 °С (денатура-
ция на матрична ДНК)
в) 30 секунди при 68 °С (хибриди-
зация на праймерите)
г) 45 секунди при 72 °С (удължава-
не на копията)
1 цикъл от
д) 5 минути при 72 °С (окончател-
но удължаване)
е) спиране при 4 °С.
NB: Тази програма е оптимизирана за изпол-
зване с термоцикльор MJ Research PTC 200. При
използване с други модели може да е необходи-
ма модификация на продължителността на стъп-
ки б), в) и г).
2.4. Анализ на фрагментите по отношение на
рестрикционните ензими.
PCR продуктите, амплифицирани от ДНК на
R. solanacearum, произвеждат ясно изразен поли-
морфизъм по дължината на рестрикционните фраг-
менти с ензим Taq I след инкубиране при 65 °С за
30 минути. Рестрикционните фрагменти, получе-
ни от специфичен за R. solanacearum фрагмент, са
с размери 457 бд и 96 бд (базови двойки).
3. Сложен PCR протокол с вътрешна PCR кон-
трола (Pastrik et al., 2002)
3.1. Олигонуклеотидни праймери
Прав праймер
5'- ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA -3'
RS-1-F
Обратен праймер
5'- CCC AGT CAC GGC AGA GAC T -3'
RS-1-R
Прав праймер
5'- AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G -3'
NS-5-F
Обратен праймер
5'- GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC -3'
NS-6-R
Очакван размер на фрагмент от R. solanacearum
матрична ДНК = 718 бд (набор RS-праймери)
Очакван размер на фрагмент от 18S рРНК вът-
решна PCR контрола = 310 бд (набор NS-праймери)
3.2. Микс за PCR реакцията
Реагент
Количество
Крайна кон-
за реакция
центрация
Стерилна ултрачиста вода
12,625 µl
10X PCR буфер (1)
2,5 µl
1X
(15 mM MgCl2)
(1,5 mM MgCl2)
BSA (фракция V) (10 %)
0,25 µl
0,1 %
d-NTP микс (20 mM)
0,125 µl
0,1 mM
Праймер RS-1-F (10 µM)
2,0 µl
0,8 µM
Праймер RS-1-R (10 µM)
2,0 µl
0,8 µM
Праймер NS-5-F (10 µM) (2)
0,15 µl
0,06 µM
Праймер NS-6-R (10 µM) (2)
0,15 µl
0,06 µM
Taq полимераза (5 U/µl) (1)
0,2 µl
1,0 U
Обем на пробата
5,0 µl
Общ обем:
25,0 µl
(1) Методите са валидирани, като е използвана Taq по-
лимераза от Perkin Elmer (AmpliTaq) и Gibco BRL.
(2) Концентрацията на праймерите NS-5-F и NS-6-R са
оптимизирани за екстракция на картофени конуси, като
се използва методът на хомогенизиране и пречиства-
не на ДНК според Пастрик (2000) (виж Раздел
VI.А.6.1.а.). Повторна оптимизация на концентрации-
те на реагентите е необходима, когато е използвана
екстракция, чрез разклащане или други методи за изо-
лиране на ДНК.
3.3. Условия за PCR реакцията
Преминава се следната програма:
1 цикъл от:
а) 5 минути при 95 °С (денатурация
на матрична ДНК)
35 цикъла от:
б) 30 секунди при 95 °С (денатура-
ция на матрична ДНК)
в) 30 секунди при 58 °С (хибриди-
зация на праймерите)
г) 45 секунди при 72 °С (удължава-
не на копията)
1 цикъл от:
д) 5 минути при 72 °С (окончател-
но удължаване)
е) спиране при 4 °С.
NB: Тази програма е оптимизирана за изпол-
зване с термоцикльор MJ Research PTC 200. При
използване с други модели може да е необходи-
ма модификация на продължителността на стъп-
ки б), в) и г).
3.4. Анализ на фрагментите по отношение на
рестрикционните ензими.
PCR продуктите, амплифицирани от ДНК на
R. solanacearum, произвеждат ясно изразен поли-
морфизъм по дължината на рестрикционните фраг-
менти с ензим Bsm I или с Isoschizomere (например
Mva 1269 I) след инкубация при 65 °С за 30 минути.
4. Специфичен за биовари на R. solanacearum
PCR протокол (Pastrik et al., 2001)
4.1. Олигонуклеотидни праймери
Прав праймер Rs-1-F
5'- ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA -3'
Обратен праймер
5'- CCC AGT CAC GGC AGA GAC T -3'
Rs-1-R
Обратен праймер
5'- TTC ACG GCA AGA TCG CTC -3'
Rs-3-R
Очакван размер на фрагмента от R. solanacearum
матрична ДНК:
с Rs-1-F/ Rs-1-R = 718 бд (базови двойки);
с Rs-1-F/ Rs-3-R = 716 бд (базови двойки).
4.2. Миксове за PCR реакциите
(а) PCR специфичен за биовар 1/2