Държавен вестник, бр. 2, 2014 г., стр. 126

СТР.  126	
Д Ъ Р Ж А В Е Н  В Е С Т Н И К 	
БРОЙ  2
доказване на вирусни антигени/антитела и за 
качествено и количествено определяне на ви-
русни антигени/антитела. 
Конкурентният вариант на метода се бази-
ра на инхибиция на имуноензимната реакция 
вследствие на конкуренцията на търсените и 
конюгираните с ензим антитела за едно и също 
количество антиген.
Сходни методи са: микрочастици EIA-MEIA, 
имунохемилуминесценция – СhLIA, ензимно­
свързана флуоресценция – ELFA, електрохеми-
луминесценция – ECLIA и др.
4.6.2.6. Електрофоретично разделяне на ви-
русни антигени – идентифициране на вирусните 
антигени според молекулните им тегла на денату-
риращи полиакриламидни гелове, визуализирани 
с комаси или сребърен нитрат.
4.6.2.7. Имуноблот – доказване на вирусни 
специфични антитела срещу отделни вирусни 
антигени. Принципът на метода е на основата 
на взаимодейвие на електрофоретично разделен 
вирус – специфични протеини, имобилизирани 
върху твърди носители с нерадиоактивно белязани 
вирусни поликлонални/моноклонални антитела. 
Специфичните антиген-антитяло комплекси се 
визуализират с ензимно-субстратна реакция. 
4.6.3. Изследвания за доказване и идентифи-
циране на вирусни генетични последователности:
4.6.3.1. Полиакриламидна гел-електрофореза:
Методът се използва за доказване на вируси със 
сегментиран геном. Основава се на разделянето 
на геномните сегменти в полиакриламиден гел 
под действие на електрично поле на база разме-
ра и молекулното им тегло. Техниката включва 
етапи на екстрахиране на вирусната нуклеинова 
киселина от клиничен материал, подлагането є 
на електрофореза при неденатуриращи условия 
и визуализиране (детекция) чрез оцветяване със 
сребърен нитрат.
4.6.3.2. Фрагментно-рестриктазен анализ за 
типизиране на вируси: 
Методът типизира вирусни щамове въз основа 
на консервативни последователности от вирус-
ния геном, които се разпознават от специфични 
екзонуклеазни ензими.
4.6.3.3. Полимеразна верижна реакция (PCR): 
Техниката се използва за доказване и типова 
идентификация на вирусни геноми. За изходен 
материал се използва вирусна нуклеинова ки-
селина, екстрахирана от биологични течности, 
тъкани и клетъчни популации. Реакцията се ос-
новава на ензимно експоненциално намножаване 
(амплифициране) на дефинирани консервативни 
нуклеотидни последователности от вирусния 
геном с помощта на специфични синтетични 
олигонуклеотиди. Отчитането на резултата е 
автоматизирано спектрофотометрично, изотер-
мално или друго (при real-time технологията) 
или визуално на УВ трансилюминатор или 
друго спрямо подходящ молекулен маркер при 
провеждане на агарозна гел-електрофореза и 
оцветяване на получения гел с етидиев бромид 
или други оцветители. Когато вирусният обект 
е PHK, съдържащ вирус, предварително се при-
лага ензимна обратнотранскриптазна реакция 
in vitro (RT) с използване на неспецифични или 
специфични синтетични олигонуклеотиди.
Техниката се прилага също за определяне 
на наличие (качествено) или концентрация (ко-
личествено) на вирусни геноми в биологични 
течности/тъкани, както и за проследяване на 
вирусното размножение – количествено или ка-
чествено (наличие, липса) и за оценка на ефекта 
при прилагане на антивирусни терапии.
Разновидности на реакцията по отношение 
начина на отчитане са хибридизационните 
техники (line probe assay, microarray и др.). Тези 
разновидности се използват и за генотипова/
субгенотипова идентификация.
4.6.3.4. Секвенционен анализ:
Методът се използва за доказване на вирусни 
геноми и за идентификация на вирусен щам/
генотип/вариант. Техниката представлява авто-
матизирано определяне на линейната последова-
телност от нуклеотидни бази, изграждащи вирусен 
геном или негов участък. За изходен материал 
се използва продукт на PCR реакцията или кло-
нирани в подходящ векторен плазмид вирусни 
гени. Основава се на формиране на маркирани 
с флуоресцентни багрила радиоактивни изотопи 
и други различни по дължина фрагменти-копия 
на даден вирусен участък и разделяне на така 
формираните белязани олигонуклеотиди чрез 
електрофореза при непрекъснато сканиране с 
лазерен лъч. 
Методът дава възможност за пълно идентифи-
циране на нуклеотидните последователности на 
вирусния геном и определяне на единични точкови 
мутации. Намира все по-широко приложение за 
определяне на резистентност при прилагане на 
антивирусни терапии. Съществуват различни 
методи за определяне на вирусните секвенции.
4.6.3.5. Определяне на генотипа/субгенотипа 
на вируси чрез хибридизация със специфични 
олигонуклеотидни проби (line probe assay). 
Амплифицирани чрез RT-PCR нуклеотидни 
последователности на изследвания вирус се 
хибридизират специфично с имобилизирани на 
нитроцелулозни стрипове, специфични за гено-
типа/субгенотипа на търсения вирус олигонук-
леотидни проби. След прибавяне на специфичен 
ензимен конюгат и субстрат се отчита цветна 
реакцията върху използваните стрипове, като по 
този начин се определя генотипът/субгенотипът 
на изследвания вирус. 
5. Документация за специалността „Виру-
сология“
5.1. Образци от протоколи и стандартна опе-
ративна процедура (СОП):
5.1.1. Образец за СОП за осигуряване на ка-
чеството на резултатите от изследване:
5.1.1.1. Общи положения:
Осигуряването на качеството на резултатите 
от изследванията изисква организирането и про-
веждането на планиран надзор чрез различни 
форми на вътрешен и външен контрол.
Лабораторията трябва да има процедури за 
управление на качеството, за наблюдение на 
валидността на извършваните изследвания. 
Получените данни трябва да бъдат записвани 
по начин, който позволява да се откриват тен-
денциите, и когато се изисква, да се прилагат 
статистически методи за проверка на резултати-