Държавен вестник, бр. 17, 2004 г., стр. 29

Б Р О Й  17
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
С Т Р .  29
да се използва за доказване на същия в левкоцитни кул-
тури, в които не се е наблюдавала хемадсорбция, като по
този начин се идентифицират нехемадсорбиращите ща-
мове на вируса. Чрез DIF се разграничава също цитопа-
тичният ефект, предизвикан от вируса на АЧС и от други
вируси, например вируса на болестта на Ауески или от
този вследствие заразяване с цитотоксичен инокулум.
Процедура
Изготвят се криостатни срезове, отпечатъчни пре-
парати от изследваните тъкани или от клетъчния седи-
мент от заразени левкоцитни култури върху предметни
стъкла, изсушават се на въздух и се фиксират с ацетон
за 10 min при стайна температура.
Обработват се с флуоресцеин изотиоцианат (FITC)-
конюгиран анти-вирус АЧС имуноглобулин в работно
разреждане за 1 h при 37 °С във влажна камера.
Едновременно с това се фиксират и обработват с
конюгат положителни и отрицателни препарати.
След промиване с фосфатно-буферен разтвор и об-
работка на препаратите с глицеринов буфер същите се
наблюдават под ултравиолетов светлинен микроскоп.
Отчитане на резултатите: Положителни за присъст-
вие на АЧС вирусен антиген са проби, в които се наблю-
дава специфична грануларна цитоплазматична флуорес-
ценция в паракортикалните тъкани на лимфоидните ор-
гани или във фиксираните макрофаги в другите органи.
1.4. Доказване наличието на вирусна нуклеинова
киселина чрез полимеразно-верижна реакция (PCR).
Чрез PCR-техниката се доказват и идентифицират
широк кръг от изолати, принадлежащи към всички
известни генотипове на вируса, включително нехемад-
сорбиращи вируси и изолати с ниска вирулентност.
Реакцията е подходяща за идентификация на вирусната
ДНК в загнили тъкани, които не са подходящи за вирус-
на изолация и доказване на антиген.
Изследванията за генетично типизиране на вируса чрез
PCR се извършват в Референтната лаборатория за АЧС
на Европейския съюз, Валдеомос, Мадрид, Испания.
1.5. Биологична проба (инокулация на прасета).
Използва се за разграничаване на АЧС от класичес-
ката чума по свинете (КЧС), които имат неразличими
клинични и патологоанатомични признаци. Заразяват
се две групи прасета, животните в едната от които са
били ваксинирани срещу КЧС, а в другата са невакси-
нирани. След заразяване в случай на АЧС умират пра-
сетата и от двете групи, а в случай на КЧС—само тези
от групата с неваксинирани животни.
2. Доказване на антитела срещу вируса на АЧС
2.1. Ензим-свързан имуносорбентен метод (ELISA).
Методът е директен и с него може да се доказва
наличието на антитела срещу вируса на АЧС у прасета,
които са били инфектирани с ниско или средно виру-
лентни вирусни щамове на АЧС.
Приготвяне на антиген
Антигенът се приготвя от заразени с вируса на АЧС
клетки, в растежната среда на които присъства свин-
ски серум.
За целта с адаптиран вирус се заразява стабилна
линия от маймунски клетки, след което същите се ин-
кубират в среда, съдържаща 2 % свински серум, за пе-
риод от 36—48 часа, докато цитопатичният ефект е ек-
стензивен.
Промиват се с фосфатно- буферен разтвор, седимен-
тират се при 650 g за 5 min, клетъчният пелет се проми-
ва в 0,34 М захароза в 5 mM Tris-HCl, рН 8,0 и се цент-
рофугира за пелетиране на клетките.
При температура, по-ниска от 0°С, утайката с клет-
ки се ресуспендира в 67 mM захароза в 5 mM Tris-HCl,
рН 8,0; след 10 min се добавя детергент без йони до
крайна концентрация от 1 %; изчаква се 10 min до ли-
зиране на клетките, добавя се захароза до крайна кон-
центрация от 64 % в 0,4 М Tris-HCl, рН 8,0 и се центро-
фугира при 1000 g за 10 min.
Супернатантата се събира, добавя се EDTA (2 mM
крайна концентрация), бета-меркаптоетанол (50 mM край-
на концентрация) и NaCl (0,5 М крайна концентрация) в
0,25 mM Tris-HCl, рН 8,0. Инкубира се за 15 min при 25 °С.
Центрофугира се при 100 000 g за 1 час при 4 °С върху
подложка от 20 % захароза в 50 mM Tris-HCl, рН 8,0.
Антигенът се съхранява при минус 20 °С.
Процедура
ELISA плаката се натоварва с антиген чрез накапване
във всяка ямка по 100 µl от работно разреждане на анти-
гена в 0,05 М карбонатно-бикарбонатен буфер с рН 9,6.
Плаката се инкубира при 4 °С за 16 часа (една нощ),
след което се промива петкратно с 0,05 % Tween 20 в
PBS, рН 7,2.
Изследваните серуми, положителните и отрицател-
ните контролни серуми се разреждат 1:30 в 0,05 Tween
20 в PBS, рН 7,2 и се накапват по 100 µl от всеки серум
двойно в ямките на натоварената плака. В различни
части на плаката се накапват четири двойки от всеки
положителен и отрицателен серум. Инкубира се при
37 °С за 1 h, след което петкратно се промива с 0,05 %
Tween 20 в PBS , рН 7,2.
Във всяка ямка се накапва по 100 µl конюгат проте-
ин-А/пероксидаза в 0,05 % Tween 20 в PBS, инкубира се
при 37 °С за 1 h, след което петкратно се промива с
0,05 % Tween 20 в PBS.
Във всяка ямка се накапва по 100 µl субстрат (10µµl
водороден прекис в 25 ml 0,04 % ортофенилендиамин
във фосфатно-цитратен буфер, рН 5,0), инкубира се на
стайна температура около 10 min, като след промяната
на цвета реакцията се стопира чрез добавяне на 100 µl
3 N сярна киселина.
Отчитане на резултатите
Резултатите се отчитат чрез спектрофотометрично
изследване при 492 nm на ELISA ридер. За положите-
лен се счита всеки серум, който има абсорбатно ниво,
по-високо от двойното средно абсорбатно ниво на кон-
тролните отрицателни серуми на плаката.
2.2. Индиректен имунофлуоресцентен метод (IDIF).
Методът се използва като потвърдителен за кръвни
серуми от зони, свободни от АЧС, които са били поло-
жителни в ELISA, и за серуми от ендемични зони, по-
казали съмнителен резултат при ELISA.
Приготвя се суспензия от заразени с вируса на АЧС
клетъчни култури от свински бъбрек или клетъчна
линия от маймунски клетки в концентрация 5 Ч 105
клетки/ ml, малки капки се наслояват върху предмет-
ни стъкла, изсушават се на въздуха и се фиксират с
ацетон при стайна температура за 10 min. Съхраняват
се при минус 20 °С.
Изследваните серуми се загряват при 56 °С за 30
min. След разреждане в буферен солеви разтвор същи-
те заедно с положителни и отрицателни контролни
серуми се накапват върху препаратите от заразени и
незаразени клетъчни култури, инкубират се за 1 h при
37 °С във влажна камера, след което се промиват с PBS
и с дестилирана вода.
Върху всички препарати се накапва анти-свински
имуноглобулин-FITC конюгат или протеин А-FITC
конюгат в работно разреждане, след което същите се
инкубират за 1 h при 37 °С във влажна камера.
Препаратите се промиват с PBS и с дестилирана
вода, накапват се с PBS (глицеролов буфер) и се наблю-
дават под ултравиолетов светлинен микроскоп.
След установяване на положителен резултат от по-
ложителния контролен серум върху заразени клетъчни
култури и отрицателен резултат при всички останали
контролни препарати тестът може да бъде отчетен.
Серумите са положителни, когато заразените клетъч-
ни култури показват специфична флуоресценция.
Като потвърдителни тестове в някои диагностични
лаборатории могат да се използват методите имуноб-
лотинг и имуноелектро-осмоза.