Държавен вестник, бр. 7, 2007 г., стр. 50

С Т Р .  50
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  7
 От този изходен разтвор се приготвят чрез
последователно разреждане със сместа (4.5)
следните разтвори:
S8
1
IU/ml
S4
0,5
IU/ml
S2
0,25
IU/ml
S1
0,125
IU/ml.
6. Приготвяне на екстракта и разтворите за
извършване на анализ
6.1. Извличане
Претегля се проба от 20 g при храни за жи-
вотни и от 1 до 20 g при предварително пригот-
вени смеси. Добавят се 100 ml от сместа (4.5) и
се разтръсква в продължение на 30 min. Цент-
рофугира се или се декантира и плаващият по
повърхността слой се разрежда с разтвора (4.5),
за да се получи очаквано съдържание на спира-
мицин от 1 IU/ml (= U8).
За очаквани нива на спирамицин, по-ниски
от 2,5 mg/kg храна за животни, извличането се
извършва, както следва: претеглят се 20 g про-
ба; добавят се 100 ml от сместа (4.5) и се раз-
тръсква в продължение на 30 min; центрофуги-
ра се в продължение на няколко min, вземат се
50 ml от плаващия на повърхността разтвор и се
изпаряват до около 4 ml при намалено налягане
в ротационен изпарител при температура, не-
превишаваща 40 °С. Остатъкът се разрежда със
сместа (4.5), за да се получи очаквано съдържа-
ние на спирамицин от 1 IU/ml (= U8).
6.2. Разтвори за извършване на анализ
От разтвор U8 се приготвят разтвори U4
(очаквано съдържание 0,5 IU/ml), U2 (очаквано
съдържание 0,25 IU/ml) и U1 (очаквано съдър-
жание 0,125 IU/ml) чрез последователно разреж-
дане (1+1) със сместа (4.5).
7. Процедура на извършване на анализа
7.1. Посяване на средата за изпитване
В средата за изпитване (4.2) се посява бак-
териалната суспензия (3.2) при около 50 °С.
Чрез предварителни опити в петрита със сре-
да за изпитване (4.2) се определя количество-
то на бактериалната суспензия, необходимо
да се получат най-големите и най-ясни зони
на инхибиране с различна концентрация на
спирамицин.
7.2. Подготовка на петритата
Дифузията през агар-агар се извършва в пет-
рита с четирите концентрации на стандартния
разтвор (S8, S4, S2 и S1) и четирите концентра-
ции на анализирания разтвор (U8, U4, U2 и U1).
Тези четири концентрации на екстракта и стан-
дарта трябва задължително да се поставят във
всяко петри. В тази връзка се избират петрита,
достатъчно големи, за да позволят в средата
агар-агар да се направят поне 8 отвора с диаме-
тър от 10 до 13 mm и не по-малко от 30 mm
между центровете. Тестът трябва да се извър-
ши в петрита, състоящи се от лист стъкло, пок-
рит с алуминиев или пластмасов пръстен, пос-
тавен отгоре, с вътрешен диаметър 200 mm и
височина 20 mm.
В петритата се излива част от средата (4.2),
посята както в 7.1, за да се получи слой, дебел
около 2 mm (60 ml за петри с диаметър 200
mm). Оставя се да се изравни, пробиват се дуп-
ките и в тях се обозначават точно премерени
обеми от разтворите за анализиране и стан-
дартните разтвори (между 0,10 и 0,15 ml на дупка
в зависимост от диаметъра). Всяка концентра-
ция се полага поне 4 пъти, така че на всяко
определяне да подлежат на оценка 32 зони на
инхибиране.
7.3. Поставяне в инкубатор
Петритата се поставят в инкубатор за 16—18
часа при температура 30 ± 2 °С.
8. Оценяване
Измерва се диаметърът на зоните на инхи-
биране с точност 0,1 mm. Отбелязват се сред-
ноаритметичните стойности на измервания-
та за всяка концентрация върху милиметрова
хартия, показваща логаритъма на концентра-
циите във връзка с диаметрите на зоните на
инхибиране. Начертават се линиите на най-
добро съответствие на стандартния разтвор и
екстракта.
Определя се “най-точно съответстващата”
точка за стандартното най-ниско ниво (SL), като
се използва формулата:
7S1 + 4S2 + S4—S8
SL = ––––––––––––  .
10
Определя се “най-точно съответстващата”
точка за стандартното най-високо ниво (SH),
като се използва формулата:
7S8 + 4S4 + S2—S1
SH =––––––––––––  .
10
По подобен начин се изчисляват и “най-точ-
но съответстващите” точки за най-ниските нива
на екстракта (UL) и най-високите нива на екс-
тракта (UH), като във формулите се заменят S1,
S2, S4 и S8 с U1, U2, U4 и U82 .
Изчислените стойности на SL и SH се нана-
сят на същата милиметрова хартия и се свър-
зват, за да се получи линията на “най-точно съ-
ответствие” за стандартния разтвор. По подо-
бен начин се нанасят UL и UH и се свързват, за
да се получи линията на “най-точно съответст-
вие” за екстракта.
При отсъствие на интерференции линиите
трябва да са паралелни. За практически цели
линиите могат да се считат паралелни, ако стой-
ностите (SH—SL) и (UH—UL) не се различават
с повече от 10% от тяхната средна аритметична
стойност.
Ако се окаже, че линиите не са паралелни, u1
и s1 или u8 и s8 могат да се изключат и SL, SH,
UL и UH да се изчислят, като се използват ал-
тернативните формули, за да се получат лини-
ите на “най-точно съответствие”:
2 Малките букви “s” и “u” се отнасят за диаметрите
на зоните на инхибиране.