Държавен вестник, бр. 98, 2002 г., стр. 15

Б Р О Й  98
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
С Т Р .  15
5.3.1.2.2. Титрация: приготвя се двойна серия
разреждане на тестираните серуми и положител-
ните контроли (100 µl/на ямка от 1:10 до 1:280).
Отрицателните контроли се разреждат 1:10.
5.3.1.3. Конюгат
Добавя се по 50 µl/на ямка предварително раз-
реден моноклонално антитяло срещу VP7, марки-
рано с пероксидаза, като след хомогенизиране и
разбъркване престоява 30 мин. при 37 °С.
5.3.1.4. Плаките се промиват петкратно с PBST
и се подсушават.
5.3.1.5. Хромоген/субстрат
Прибавят се по 100 µl/на ямка хромоген/субст-
ратен разтвор (1мл ABTS (2,2’-Azino-bis-[3-етил-
бензотиазолин-6-sulphuric acid]) 5 mg/ml + 9 ml
субстратен разтвор / 0,1 M фосфатно-цитратен бу-
фер с рН 4, съдържащ 0,03 % H2O2/ и се инкубира
в продължение на 10 мин. на стайна температура.
Оцветяването се спира чрез прибавяне на 100 µl/на
ямка 2 % (w/v) SDS (sodium dodecyl sulphate).
5.3.1.6. Отчитане
Извършва се посредством ЕЛАЙЗА ридър при
дължина на вълната 405 nm.
5.3.2. Интерпретиране на резултатите.
5.3.2.1. Валидност на теста
Той е валиден, когато оптичната плътност на
отрицателната контрола (ОК) е по-висока от 1,0,
а тази на положителната контрола (ПК) е по-
ниска от 0,2.
5.3.2.2. Изчисляване на пределните стойности:
положителна стойност (ПК)—ОК—(ОК—ПК) Ч 0,3;
отрицателна стойност (ОК)—ОК—(ОК—ПК) Ч 0,2,
където ОК е екстинцията на отр. контрола, а ПК—
на положителната.
5.3.2.3. Интерпретиране на резултатите
Проби с екстинция, по-ниска от положителна-
та стойност, се считат за положителни за антите-
ла срещу АЧКВ.
Проби с екстинция, по-висока от отрицателна-
та стойност, се считат за отрицателни за антитела
срещу АЧКВ.
Проби с екстинция между тези две стойности се
считат за съмнителни, като две до три седмици след
това се вземат нови кръвни проби от същите жи-
вотни и се подлагат отново на изследване с теста.
5.4. Имуноблотинг тест
Свързването на антитела с вирусни протеини,
разделени при електрофореза и след това прехвър-
лени върху нитроцелулозна мембрана, също се
прилага като метод за доказване на антитела сре-
щу вируса на АЧК.
5.4.1. Тест процедура
Полупречистените протеини от вируса на АЧК
се разделят с помощта на SDS-PAGE (sodium
dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis)
в 15 % acrylamide-N,N’-diallytartar-diamide (DATD)
гел. Така разделените протеини се трансферират
върху нитроцелулозни мембранни филтри при
постоянен ток със сила 280 mA за 6 часа при 4 °С.
Нитроцелулозните мембрани се изрязват и се об-
работват с тестираните серуми в разреждане 1:20,
след това с конюгат, маркиран с пероксидаза за-
ешки антиконски имуноглобулин—1:500, и се ин-
кубира за 1 час на 37 °С. Оцветяването на бендовете
се извършва посредством 4-хлор—нафтол техника.
съдържащ PBS + 5 % обезмаслено сухо мляко
“Нестле” + 0,05 % Tween 20, и се накапват в
количество по 100 µl / на ямка с последвала ин-
кубация от 1 час на 37 °С. При титрирането се
прави двойна серия разреждания в цяла колон-
ка, като същото важи и за положителния и отри-
цателния серум.
5.2.1.2.2. Плаките се промиват, както е описано
в т. 2.
5.2.1.3. Конюгат
5.2.1.3.1. Антиконски глобулин, маркиран с пе-
роксидаза, разреден в разтвор, съдържащ PBS +
5 % обезмаслено сухо мляко “Нестле” + 0,05 %
Tween 20 с рН 7,21, се поставя по 100 µl във всяка
ямка, с последвала инкубация 1 час на 37 °С.
5.2.1.3.2. Плаките се промиват, както е описано
в т. 2.
5.2.1.4. Хромоген/субстрат
Във всяка ямка се поставя по 200 µl / на ямка
субстратен разтвор (10 мл 80,6 mM DMAB (dimethyl
aminobenzaldehyde) + 10 мл fj 1,56 mM MBTH (3-
methyl-2-benzo-thiazolinone hydrazone) + 5 µl H2O2).
Цветната реакция се спира чрез прибавяне на 50 µl
разтвор на 3N H2SO4 за около 5—10 мин., преди
отрицателната контрола да започне да се оцветява.
5.2.1.5. Плаките се отчитат на ридър при дъл-
жина на вълната 600 или 620 nm.
5.2.2. Интерпретиране на резултатите
5.2.2.1. Първо се изчислява cut-off стойността,
както следва—С + 0,06 (където С е стойността на
отрицателната контрола, 0,6 е стандартното от-
клонение, получено при група от 30 отрицателни
серума).
5.2.2.2. Пробите, показали стойност, по-ниска
от тази, се смятат за отрицателни.
5.2.2.3. При по-големи стойности от cut-off +
0,15 се считат за положителни.
5.2.2.4. Пробите, показали лъжливо положител-
ни резултати, се подлагат отново на изследване за
потвърждаване на резултатите.
5.3. Блокираща ЕЛАЙЗА за доказване на анти-
тела срещу вируса на АЧК
Чрез метода се доказват специфични антитела
срещу вируса на АЧК в серуми от възприемчиви
към болестта животни. Основен антиген на реак-
цията е VP7 протеинът, който е основен за всички-
те девет серотипа. Този метод се извършва в рефе-
рентната лаборатория по АЧК на Европейската
общност в Алхете, Испания.
5.3.1. ЕЛАЙЗА тест
5.3.1.1. ЕЛАЙЗА плаки
5.3.1.1.1. Плаките се натоварват с рекомбинан-
тен АЧКВ VP7, разреден в карбонатно-бикарбона-
тен буфер с рН 9,6, с последвала инкубация за една
нощ при 4 °С.
5.3.1.1.2. Плаките се промиват петкратно с PBS,
съдържащ 0,05 % v/v Tween 20 (PBST).
5.3.1.1.3. Плаката се стабилизира със стабили-
зиращ разтвор, което позволява тя да престоява
продължително време на 4 °С.
5.3.1.2. Контроли със серумни проби
5.3.1.2.1. Скрининг тест серумите и контролите
се разреждат в PBST 1:10 директрон върху плаката
до получаване на краен обем 100 µl/на ямка, с пос-
ледвала инкубация от 1 час при 37 °С.