Държавен вестник, бр. 98, 2002 г., стр. 14

С Т Р .  14
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  98
5.1.1.2. Плаките се промиват трикратно с PBS с
рН 7,2—7,4, след което се подсушават.
5.1.2. Контролни ямки на плаките
5.1.2.1. Положителните контролни серуми се
титрират в двойна серия разреждане, започващи
от 1:5 до 1:640, в колона 1 в блокиращ буфер (PBS
+ 5 % обезмаслено сухо мляко Cadbury’s Marvel
TM + 0,05 % w/v Tween 20 и 1 % ГСА) до получа-
ване на 50 µl на ямка.
5.1.2.2. Към ямки А и В от колона 2 се добавя
50 µl от отрицателния серум при разреждане 1:5
(10 µl серум + 40 µl блокиращ буфер).
5.1.2.3. В ямки С и D от колона 2 (празна) се
добавя 100 µl на ямка блокиращ буфер.
5.1.2.4. В ямки E, F, G и H от колона 2 се накап-
ва 50 µl блокиращ буфер.
5.1.3. Метод за единична титрация:
Прибавя се в разреждане 1:5 серум в блокиращ
буфер в колоните от 3 до 12 (10 µl серуми + 40 µl
блокиращ буфер).
Или:
5.1.4. Метод на титрацията:
Приготвят се двойни серийни разреждания от
1:5 до 1:640 в блокиращ буфер в осем ямки от еди-
нични колони (3 до 12).
След което:
5.1.5. Добавят се 50 µl антисерум от морско свин-
че, предварително разреден в блокиращ буфер във
всички ямки на плаката с изключение на празните
(така навсякъде количеството е 100 µl на ямка).
5.1.5.1. Плаките се инкубират за 1 час при 37 °С
върху орбитален шейкър.
5.1.5.2. Плаките се промиват трикратно, след
което се подсушават.
5.1.5.3. Към всяка ямка се прибавя 50 µl коню-
гат: заешки антиморскосвински пероксидаза, пред-
варително разтворен в блокиращ буфер.
5.1.5.4. Инкубира се в продължение на 1 час при
37 °С върху орбитален шейкър.
5.1.5.5. Плаките се промиват трикратно и се
подсушават.
5.1.6. Хромоген
Ортофенилендиаминовият разтвор се пригот-
вя според инструкциите (0,4 мг/мл в стерилна дес-
тилирана вода) непосредствено преди употреба.
Добавя се субстрат водороден прекис до крайна
концентрация 0,05 % v/v (1 към 2000 на 30 % раз-
твор на Н2О2). Във всяка ямка се накапва по 50 µl
от ОФД разтвора, като след 10-минутен престой
на стайна температура реакцията се спира чрез при-
бавяне на ямка 50 µl 1М H2SO4.
5.1.7. Отчитане
Извършва се на ЕЛАЙЗА ридър при дължина
на вълната 492 nm.
5.1.8. Интерпретиране на резултатите
5.1.8.1. С помощта на софтуерна програма се от-
читат резултатите от оптичната плътност. За вали-
диране на теста е необходимо горната граница и
долната контролна граница на серума от морско
свинче да са между 1,4 и 0,4. Крайният титър за по-
ложителния контролен серум, базиран на 50 %, трябва
да бъде 1:240 в граници от 1:120 до 1:480. Всяка пла-
ка, която не отговаря на стандарта, трябва да се из-
хвърли. Въпреки това, ако при отрицателните серу-
ми титърът е 1:480 и нагоре, те могат да се приемат
за отрицателни. Двойните серумни ямки на отрица-
телната контрола и празните трябва да дават стой-
ности съответно между + 25 % и—25 % и между
+ 95 % и + 105 %. При положение че стойностите са
извън тези граници, това не означава, че плаката е
невалидна, а е признак за оцветяване.
5.1.8.2. Проби, даващи инхибиция повече от 50 %,
се считат за положителни. Проби, при отчитането
на които стойностите са под 50 %, се считат за от-
рицателни. При двойните проби, при които се уста-
новяват стойности от различните кладенчета под и
над 50 %, се считат за съмнителни. Обикновено
тези проби се подлагат на повторно изследване.
Положителните проби също могат да се титрират с
цел да се установи степента на положителност.
5.1.3. Метод за единична титрация
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12
+контр.
Тест серуми
 A
1:5
—контр.
 B
1:10
—контр.
 C
1:20
Празен
 D
1:40
Празен
 E
1:80
MC контр.
 F
1:160
MC контр.
 G
1:320
MC контр.
 H
1:640
MC контр.
—контр. = отрицателна контрола
+ контр. = положителна контрола
MC контр.= контрола “морскосвински” серум
5.1.4. Метод на титрация
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12
+контр.
Тест серуми
 A 1:5
—контр.
1:5
1:5
 B
1:10
—контр.
1:10
1:10
 C
1:20
Празен
1:20
1:20
 D 1:40
Празен
1:40
1:40
 E
1:80
MC контр. 1:80
1:80
 F
1:160
MC контр. 1:160
1:160
 G 1:320
MC контр. 1:320
1:320
 H 1:640
MC контр. 1:640
1:640
—контр. = отрицателна контрола
+ контр. = положителна контрола
MC контр.= контрола “морскосвински” серум
5.2. Индиректна ЕЛАЙЗА за доказване на ан-
титела
Тестът използва VP7 протеина като антиген за
установяване на антитела срещу вируса на АЧК
5.2.1. Процедура на теста:
5.2.1.1. Твърда фаза
5.2.1.1.1. Плаките се натоварват с рекомбини-
ран АЧКВ 4 VP7, разреден в карбонатно-бикарбо-
натен буфер с рН 9,6, след което се инкубират една
нощ на 4 °С.
5.2.1.1.2. Плаките се промиват петкратно с дес-
тилирана вода, съдържаща 0,01 % Tween20.
5.2.1.1.3. Накапва се по 200 µl / на ямка блоки-
ращ разтвор, съдържащ PBS + 5 % обезмаслено
сухо мляко “Нестле”, с престой 1 час на 37 °С.
5.2.1.1.4. Внимателно се излива блокиращият
разтвор и плаките се подсушават.
5.2.1.2. Серумни проби:
5.2.1.2.1. Серумите заедно с положителния и
отрицателния серум се разреждат 1:25 в разтвор,